光诱导的液滴数字重组酶聚合酶扩增技术结合侵入性反应，实现了超快速的抗菌药物敏感性检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Photo-initiated droplet digital recombinase polymerase amplification coupled with invasive reactions enables ultra-fast antimicrobial susceptibility testing

【字体：大中小】 时间：2025年12月30日 来源：Biosensors and Bioelectronics 10.7

编辑推荐：

　　本研究提出光触发的微滴数字重组酶聚合酶扩增（PIRATE）方法，将血液感染病原体抗生素敏感性检测时间从3天缩短至6小时内。通过光解抑制的引物设计，实现微滴中即时启动扩增，8分钟完成定量检测，与标准AST方法100%结果一致，灵敏度达3 CFU/mL。

张立坤|陈晨|冯丽颖|王伟萍|马学平|马毅|单静文|王圆梦|王颖|吴海平|周国华

南京大学医学院附属金陵医院临床药学系，南京，210002，中国

摘要

抗菌药物敏感性测试（AST）对于指导及时的抗生素治疗至关重要。然而，传统的AST需要几天时间才能出具报告。尽管数字聚合酶链反应（dPCR）可以通过在短时间抗生素暴露后确定细菌的敏感性来缩短AST的周转时间，但这一过程仍然耗时较长。重组酶聚合酶扩增（RPA）由于在室温下进行且避免了扩增产物变性和引物退火，因此效率更高。然而，将RPA适应到数字格式一直具有挑战性，因为扩增在分离之前就开始了，这不可避免地导致结果偏高。在这里，我们提出了一种光启动的液滴数字RPA（ddRPA）方法，消除了预扩增步骤。我们修改了RPA引物中的三个碱基，使其具有光裂解基团，从而仅在光照后启动ddRPA。由于RPA在液滴中的高效性，定量分析仅需8分钟。基于这种光控策略，我们开发了一个用于血流感染（BSI）病原体的超快速AST平台（PIRATE）。使用肺炎克雷伯菌和粪肠球菌作为模型系统，PIRATE在33个临床分离株和8份血液样本中的结果与标准AST结果完全一致，同时将周转时间从3天缩短到不到6小时。这种方法在指导精确抗生素处方方面显示出巨大潜力。

引言

败血症是由血流感染（BSI）引起的全身性炎症反应综合征，是全球死亡率的主要原因之一（Fleischmann等人，2016年）。有效管理BSI患者依赖于及时给予有效的抗生素（Rudd等人，2020年），因此需要快速的抗菌药物敏感性测试（AST）。然而，目前针对BSI病原体的标准AST工作流程，包括血液培养、纯培养、病原体鉴定和抗生素敏感性分析，通常需要3-5天（Tjandra等人，2022年）。在这种情况下，临床医生在获得AST结果之前不得不采用经验性广谱抗生素治疗。这种诊断延迟凸显了开发超快速AST检测方法以进行针对性抗生素治疗的迫切需求。

目前，针对血流感染的快速AST面临两个主要挑战：病原体载量低（通常为1-100 CFU/mL）和血液成分复杂（Tjandra等人，2022年）。尽管已经开发了几种用于裂解真核细胞和富集细菌的AST方法，但对于菌量低于10 CFU/mL的样本，这些预处理步骤难以应用（Forsyth等人，2021年；Narayana Iyengar等人，2021年）。最近，开发了一种快速AST平台（uRAST），利用合成的β-2-糖蛋白I（sβ2GPI）修饰的磁珠直接从全血中捕获低丰度细菌（Kim等人，2024年）。尽管uRAST达到了1 CFU/mL的检测限（LOD），但其周转时间约为13小时，仍长于临床医生的要求。通常，临床医生每6-8小时就需要重新评估抗生素的选择；因此，如果能够将AST周转时间缩短至6小时，患者的预后可以得到改善（Munson等人，2003年）。由于uRAST基于光学原理，它至少需要6小时进行抗生素暴露。因此，减少抗生素暴露时间是实现BSI病原体超快速AST的关键。

为了最小化抗生素暴露时间，人们用细菌基因组DNA（gDNA）的定量替代了细菌菌落的光学检测，从而能够在单次倍增时间内检测到抗生素暴露后的细菌数量变化（Feng等人，2022年；Schoepp等人，2017年；Schoepp等人，2016年）。我们开发了一种基于PCR-焦磷酸测序的快速AST方法，在抗生素暴露15-45分钟后定量细菌衍生的条形码（Feng等人，2022年），能够在4小时内完成尿液样本中目标细菌的AST检测。然而，这种方法在准备步骤繁琐且容易受到交叉污染的影响。

另一种直接定量细菌gDNA的方法是数字核酸定量（Schoepp等人，2017年；Schoepp等人，2016年）。由于该方法分辨率非常高，它可以在抗生素暴露后15分钟内检测到gDNA拷贝数的微小变化。然而，数字定量基于环介导等温扩增（LAMP），通常在60-65°C下进行，且设置繁琐，因为需要三对引物（Schoepp等人，2017年）。

与LAMP相比，重组酶聚合酶扩增（RPA）更适合即时检测（POCT），因为其操作温度较低（37-42°C，甚至在室温下也可进行）（Li等人，2018年）。此外，RPA在引物杂交过程中通过独特机制具有更高的扩增效率（Li等人，2018年）。基于RPA，我们开发了一种由flap内切酶1（FEN1）辅助的RPA（FARPA）方法，能够实现多重检测（Ma等人，2023年）。为了实现适用于POCT的超快速AST，我们建议使用FARPA进行数字定量。

然而，直接将FARPA适应到数字格式具有挑战性，因为RPA在分离步骤之前就在室温下开始了，这不可避免地导致结果偏高（Choi等人，2023年；Cui等人，2022年）。为了实现ddRPA，一种简单的策略是分离RPA的一个关键组分以防止预扩增，然后将该组分加入每个微单元（例如微滴）中以触发RPA。例如，首先从RPA系统中分离出RPA反应的激活剂醋酸镁，然后在生成微滴后加入微滴中（Cui等人，2022年）。然而，将皮升级的激活剂精确分配到数万个微滴中仍然困难且繁琐。

为了实现均匀的ddRPA，我们通过修改RPA引物使其具有光裂解基团，从而在分离之前有效阻止RPA反应。经过短暂的光照（30秒）后，每个微滴中的RPA立即开始，随后进行目标识别。然后我们使用所提出的ddRPA方法建立了一种用于BSI细菌的光启动ddRPA抗性测试（PIRATE）方法。该方法可以直接应用于菌量为3 CFU/mL的全血样本。周转时间缩短到不到6小时，比标准方法快得多。高灵敏度和短周转时间表明PIRATE在促进抗生素合理使用和改善患者预后方面具有巨大潜力。

试剂和材料

试剂和材料的详细信息列在补充材料中。引物和探针的序列列在表S1中。目标序列列在表S2中。

光启动的RPA检测

RPA反应按照制造商的说明进行。准备了50 μL的反应混合物，其中包含29.4 μL的A缓冲液、0.4 μM的正向和反向RPA引物（NPOM-caged或uncaged）、2.5 μL的B缓冲液以及一管冻干酶颗粒。混合后，加入3 μL的目标gDNA样本

光启动RPA反应的发展

光控技术是调节反应过程的有效方法（Hu等人，2023年；Liu等人，2024年）。在这里，我们在RPA引物中添加了光裂解基团6-硝基哌啶氧甲基（NPOM），以防止引物与目标杂交（Chen等人，2022年；Hu等人，2023年）。当NPOM基团在365纳米（UV）紫外线照射下被光裂解后，杂交得以恢复，从而启动RPA，如图1A所示。

结论

在这项研究中，我们建立了一种光启动的ddFARPA方法，能够在8分钟内实现快速数字核酸定量。ddFARPA的主要创新之处在于利用光在室温下启动微滴中的RPA，消除了预扩增步骤。光启动的ddFARPA进一步被用于构建一种针对BSI病原体的快速AST方法（PIRATE），该方法可以确定革兰氏阳性（粪肠球菌）和革兰氏阴性细菌（肺炎克雷伯菌）的敏感性。

CRediT作者贡献声明

吴海平：监督、概念设计。周国华：写作 – 审稿与编辑、监督、项目管理。张立坤：写作 – 初稿撰写、验证、方法学。陈晨：写作 – 审稿与编辑、验证。冯丽颖：方法学、正式分析。王伟萍：监督、资源协调。马学平：数据可视化、数据管理。马毅：软件开发、实验设计。单静文：写作 – 审稿与编辑、数据可视化。王圆梦：软件开发、正式分析。