利用RT-LAMP-CRISPR/Cas12b技术在重力驱动的微流控芯片上快速检测呼吸道合胞病毒

《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：Rapid Detection of Respiratory Syncytial Virus Using RT-LAMP-CRISPR/Cas12b on a Gravity-Driven Microfluidic Chip

RSV快速检测新方法开发及性能验证：本研究创新性地将RT-LAMP与CRISPR/Cas12b结合，并设计重力驱动微流控芯片实现免提纯检测，40分钟内灵敏度达100拷贝/μL，与RT-qPCR符合率达99%，无交叉反应，适用于资源有限地区的POC诊断。

刘圆珠|梅浩坤|高畅|杨英琪

河北大学临床医学院，中国保定，071000

摘要

目的

呼吸道合胞病毒（RSV）是导致儿童急性下呼吸道感染的最重要病原体。早期检测RSV有助于控制疾病进展并减少并发症。然而，基于RT-qPCR的检测方法无法在一小时内提供准确结果，且不适用于资源有限的环境。因此，迫切需要开发一种快速、精确的床旁RSV检测方法以满足临床需求。

方法和结果

首先，我们开发了一种RT-LAMP辅助的CRISPR/Cas12b方法来检测RSV M基因，该方法能够在40分钟内以低至100拷贝/μL的检测限识别目标RNA。其次，我们制备并测试了一种采样裂解试剂，证明了其在无需核酸提取的情况下直接检测的有效性，从而提高了床旁检测效率。最后，为了便于在资源有限的地区使用，我们设计并开发了一种重力驱动的微流控芯片，简化了RT-LAMP扩增和CRISPR/Cas12b检测的步骤。这种芯片可以在无需外部电源的情况下实现结果的可视化识别，适用于即时检测（POC）环境。该检测方法的准确性与RT-qPCR相比达到了99%，显示出其在实际应用中的潜力。此外，未观察到与其他呼吸道病原体感染的交叉反应，证明了其良好的临床特异性。

结论

总之，我们开发的平台比RT-qPCR更快、更用户友好，同时具有相当的灵敏度。

影响声明

我们的发现填补了在POC环境中无法检测RSV的空白，保护了儿童的健康，并为CRISPR诊断技术的创新提供了新的见解。

引言

呼吸道合胞病毒（RSV）是一种高度流行的RNA病毒，在五岁以下儿童中的检出率很高[1]。它是导致这一年龄段儿童急性下呼吸道感染的最主要病原体[2]。RSV具有高度传染性，其传染性大约是流感的2.5倍，由于感染后缺乏持久免疫力，个体容易反复感染[3]。RSV感染对儿童尤其危险，是肺炎和毛细支气管炎最常见的病原体，尤其是在免疫系统尚未完全发育的婴儿中[4]。这一人群中RSV感染的预后较差，是导致儿童死亡的重要因素。鉴于RSV感染对儿童健康的严重威胁，早期检测病原体和准确诊断对于及时治疗和合理用药具有重要意义，最终可以改善患者预后[5]。

传统的RSV检测方法，如分离培养和免疫学检测，存在局限性，包括漫长的培养周期和免疫学检测的灵敏度低，无法快速准确地检测早期RSV感染[6]。分子生物学方法，特别是逆转录-聚合酶链反应（RT-qPCR），代表了显著的进步，提供了快速和灵敏的检测能力，能够在感染早期识别病原体[7]。因此，RT-qPCR已成为临床环境中诊断RSV感染的主要方法。然而，使用qPCR需要热循环仪、实时荧光检测系统和设备齐全的实验室，这在资源有限的地区或紧急疫情期间可能难以实现[8]。

逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）是一种广泛使用的等温核酸扩增技术，如COVID-19检测中所证明的[9]。它只需要恒定温度即可进行扩增，并且与其他等温扩增技术（如重组酶聚合酶扩增RPA）相比，对抑制剂的耐受性更强[9]，在仪器要求方面具有优势。值得注意的是，RT-LAMP对抑制剂的耐受性更强。RT-LAMP可以使用处理简单的样本进行，无需繁琐的核酸提取步骤[10]，非常适合即时检测（POC）应用。然而，消除非特异性扩增以提高检测准确性仍然是RT-LAMP在诊断病原体时的关键挑战[11]。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白（Cas）在核酸检测中的应用受到了广泛关注[12]。Cas蛋白在CRISPR RNA（crRNA）的引导下，能够高特异性地识别目标序列，触发附近荧光标记的单链DNA（ssDNA）或单链RNA（ssRNA）报告分子的切割，产生可见的荧光信号[13]。其中，CRISPR/Cas12系统可以有效地与RT-LAMP结合，提高检测的特异性[14]。Cas12a和Cas12b是CRISPR/Cas12系统中用于检测的两种蛋白类型。与Cas12a不同，Cas12b是一种嗜热Cas蛋白，在接近RT-LAMP扩增的温度下发挥作用[15]，具有更高的特异性和灵敏度，使其成为RT-LAMP的理想选择，从而实现快速准确的病原体检测[16]。

在将扩增产物转移到CRISPR系统之前，先进行RT-LAMP预扩增是必要的[17]。此过程中的DNA气溶胶污染和操作错误可能导致后续检测出现错误结果，从而影响分子诊断[18]。

虽然已经提出了“一锅法”CRISPR检测策略[19]，但有报道称扩增和CRISPR切割可能会相互抑制，延长反应时间并提高检测限（LOD），从而限制检测能力[20]。微流控芯片平台在分子诊断中显示出显著潜力和有效性[21]。将基于CRISPR的分子检测集成到微流控芯片中，尤其是那些不需要额外驱动设备的芯片，可以部分替代手动液体转移操作，为POC诊断提供更简单、更方便的支持[22]、[23]、[24]。

在这里，我们开发了一种重力驱动的CRISPR/Cas12b检测方法（GC-CARD）。

此外，我们还开发了一种无需提取的检测方法和配套的POC设备。这使得RT-LAMP扩增和CRISPR/Cas12b切割能够分步进行，从而在40分钟内实现RNA的直接和准确检测。这些进展有望满足快速RSV检测的应用需求。

材料与试剂

NEBuffer r2.1、r3.1和rCutSmart购自New England Biolabs（NEB）。RT-LAMP Master Mix、RNase抑制剂和DEPC水购自南京Vazyme Medical Technology Co., Ltd。AapCas12b购自上海Tolo Biotech Co., Ltd。L-脯氨酸、BSA、NaOH、Triton X-100和Tween 20购自Sigma-Aldrich（上海）。玻璃研磨珠购自Gene Tech（武汉）Co., Ltd。所有模板、引物、crRNA和ssDNA报告基因序列均由

建立RT-LAMP-CRISPR/Cas12b方法用于RSV检测

我们采用了之前研究中设计的RT-LAMP引物，以靶向RSV A亚型病毒的保守M基因序列[25]。此外，我们还设计了Cas12b crRNA，使其位于扩增产物上的原间隔序列（PAM）位点附近，用于CRISPR检测。引物和crRNA的序列见图2A。

最初，我们使用各种NEB缓冲液评估了RT-LAMP-CRISPR/Cas12b检测RNA基因序列的可行性。

讨论

在这项研究中，我们报告了GC-CARD在即时检测环境中快速准确检测RSV的方法。近年来，基于CRISPR/Cas的检测方法取得了快速进展，尤其是在RSV检测方面。先前的研究报道了将RT-RPA与CRISPR/Cas12a结合的系统[27]、[28]、[29]。这些方法采用“两步”策略，首先进行RT-RPA扩增，然后将扩增产物引入CRISPR/Cas12a

结论

总之，我们开发了一种无需提取的RT-LAMP和CRISPR/Cas12b方法，用于快速准确筛查呼吸道合胞病毒。结合重力驱动芯片和POC设备提高了检测过程的便利性和安全性，其性能与RT-qPCR相当。GC-CARD检测方法在临床环境中具有快速确定RSV的潜力，有望成为支持快速感染的可靠工具

CRediT作者贡献声明

刘圆珠：数据整理、撰写、审阅与编辑；梅浩坤：方法学、数据分析；高畅：方法学、数据整理；杨英琪：资源获取、概念构思。

CRediT作者贡献声明

刘圆珠：撰写、审阅与编辑、数据整理。梅浩坤：方法学、数据分析。高畅：方法学、数据整理。杨英琪：资源获取、概念构思。