《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：CRISPR/Cas9-based evidence that overexpression of
Gm-mGST1 mediates abamectin resistance in the oriental fruit moth,
Grapholita molesta
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抗性机制解析与分子验证：通过CRISPR/Cas9敲除证实谷胱甘肽S-转移酶基因Gm-mGST1介导东方果蝇对阿巴米丁的抗性，并建立代谢解毒与氧化应激防御关联。
作者：Sha Su、Xiaohe Zhang、Xinyu Wang、Caiyun Qiu、Zhimin Xu、Jaime C. Pi?ero、Xiong Peng、Fei Li、Yayun Zuo、Maohua Chen
单位：中国陕西省杨陵市西北农林科技大学植物保护学院，隶属于教育部植物保护资源与害虫管理重点实验室、国家农作物抗逆性与高效生产重点实验室以及农业农村部西北黄土高原农作物害虫综合治理重点实验室
摘要
基于阿维菌素的杀虫剂在害虫综合治理中得到广泛应用，尤其是对东方果蠹（Grapholita molesta）等果蛀虫具有显著效果。然而，快速出现的抗药性威胁着这些杀虫剂的长期有效性。本研究阐明了谷胱甘肽S-转移酶基因Gm-mGST1在东方果蠹抗阿维菌素中的作用。通过实验室筛选得到的抗性品系（AB-R）的抗性比敏感品系（AB-S）提高了85.5倍。对谷氨酸门控氯通道（GmGluCl）基因的测序未发现靶点突变，表明其抗性机制可能与代谢途径相关。在AB-R品系中，GST酶活性显著增强。GST增效剂二乙基马来酸酯（DEM）在抗阿维菌素的东方果蠹品系中的增效作用比在敏感品系中更为明显，这表明GSTs参与了抗性形成。Gm-mGST1在阿维菌素作用下表现出强烈的阶段特异性过表达。利用CRISPR/Cas9技术敲除AB-R品系中的Gm-mGST1后，抗性降低了16.3倍，从而证实了GST基因直接介导了东方果蠹的抗阿维菌素作用。重组Gm-mGST1的催化活性通过CDNB底物在体外得到了验证。此外，阿维菌素对Gm-mGST1的活性也表现出一定的抑制作用。高效液相色谱（HPLC）分析显示，重组Gm-mGST1存在时阿维菌素的峰面积显著减小，而在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中的异位表达使阿维菌素的耐受性提高了1.97倍。田间东方果蠹种群中Gm-mGST1的表达水平与其抗性水平之间存在显著正相关。这些发现表明Gm-mGST1是抗阿维菌素的关键基因，并可作为监测抗性的潜在分子标记。更广泛地说，本研究为将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于杀虫剂抗性研究奠定了基础，有助于弥合相关证据与功能验证之间的差距，并为果园害虫的抗性管理策略提供了理论框架。本研究利用CRISPR/Cas9技术证实了GSTs在昆虫抗性中的作用。
引言
杀虫剂抗性是全球农业面临的最紧迫挑战之一，威胁着作物保护、食品安全和害虫管理计划的长期有效性（Ma等人，2024；Liang等人，2025）。阿维菌素是从链霉菌（Streptomyces avermitilis）中提取的大环内酯类化合物，由于其强大的活性和良好的毒理学特性，在害虫综合治理（IPM）中发挥着关键作用。阿维菌素的主要作用机制是激活无脊椎动物体内的谷氨酸门控氯通道（GluCls）（Ishaaya等人，2002；Wolstenholme，2012），尽管也有研究表明其与离子型GABA受体存在间接相互作用（Wolstenholme，2012）。由于阿维菌素的跨膜特性，它对东方果蠹（Grapholita molesta）等果蛀虫具有特别显著的防治效果，这种害虫是全球范围内危害核果和仁果类作物的主要害虫之一（Pi?ero和Dorn，2009；Kirk等人，2013）。
然而，阿维菌素的频繁和重复使用导致多种螨虫和昆虫出现了抗药性（Kwon等人，2010；Dermauw等人，2012；Wang等人，2016；Wang等人，2017），引发了对其可持续性的担忧。从机制上看，阿维菌素抗性主要由两种途径介导：靶点不敏感性和代谢解毒（Ghosh等人，2012；Riga等人，2014）。GluCl基因的点突变已被证实与Plutella xylostella（L.）（鳞翅目：Plutellidae）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）（双翅目：Drosophilidae）和Tetranychus urticae（蛛形纲：Tetranychidae）的高抗性相关（Wang等人，2016；Sun等人，2023；Kane等人，2000；Kwon等人，2010；Dermauw等人，2012）。同时，由解毒酶驱动的代谢抗性逐渐被认为是导致节肢动物抗阿维菌素的主要因素。细胞色素P450参与了T. urticae（Riga等人，2014）和Spodoptera exigua（鳞翅目：Noctuidae）（Zuo等人，2021；Teng等人，2022；Li等人，2023）的阿维菌素代谢过程，而谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）则通过直接代谢、解毒或减轻氧化应激来促进抗性（Pavlidi等人，2015；Liao等人，2016；Pavlidi等人，2018）。在T. urticae中，TuGSTd14对阿维菌素的亲和力最高，提示其结合位点位于酶的H位点（Pavlidi等人，2015）。在Panonychus citri（McGregor）（蛛形纲：Tetranychidae）中，PcGSTm5与解毒和抗氧化保护相关（Liao等人，2016）；而在P. xylostella中，PxGSTs1则与解毒和氧化应激防御相关（Liu等人，2024）。
此前，我们的研究发现Gm-mGST1（原名GmGST11，Genbank登录号：MZ747007）在东方果蠹中暴露于阿维菌素后表达量增加了近100倍，提示其可能参与抗性形成（Su等人，2021a）。在本研究中，我们通过实验室筛选获得了抗阿维菌素的东方果蠹品系，并观察到该品系中的GST酶活性显著高于敏感品系。Gm-mGST1在AB-R品系中过表达，且GluCl基因未检测到靶点突变。为验证其功能，我们使用CRISPR/Cas9技术敲除了Gm-mGST1，在黑腹果蝇中通过PhiC31系统进行了异位表达，并通过代谢实验进行了体外验证，从而证实了其在抗性中的作用。尽管有RNA干扰（RNAi）研究的结果，但此前尚无CRISPR/Cas9研究直接证实GST基因对昆虫抗性的贡献。
本研究的主要目的是确定谷胱甘肽S-转移酶基因Gm-mGST1在东方果蠹抗阿维菌素中的作用，包括通过基因表达分析、CRISPR/Cas9敲除、原核表达、异位表达和酶活性测定来验证其抗性贡献。
研究细节
昆虫
敏感的东方果蠹品系AB-S最初来自中国陕西省杨陵市，已在实验室中保存超过七年，期间未接触过杀虫剂（Su等人，2021b）。抗阿维菌素的AB-R品系是通过连续使用LC20浓度的阿维菌素进行饮食诱导选择获得的（Su等人，2021a）。东方果蠹的幼虫在含有番茄酱和玉米的人工饲料中饲养。
东方果蠹对阿维菌素的敏感性
经过25代选择后，AB-R品系的阿维菌素抗性提高了85.55倍（LC50 = 4.534 g/L；95%置信区间：3.257-7.683），而敏感品系AB-S的LC50为0.053 g/L（95%置信区间：0.041-0.067）（表1）。
GmGluCl基因的突变检测及解毒酶活性的测定
为了检测是否存在与抗性相关的靶点突变，我们从AB-S和AB-R品系中扩增、克隆并测序了GmGluCl基因，未发现导致抗性的多态性。
讨论
谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）是一类重要的解毒酶，已知会促进昆虫的抗药性，包括对阿维菌素的抗性（Wei等人，2015；Liu等人，2024；Ding等人，2025）。尽管多项研究通过相关性证据或RNA干扰（RNAi）敲低实验表明GSTs与阿维菌素抗性有关，但至今尚未有研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术提供直接的功能验证。
作者贡献声明
Maohua Chen：撰写、审稿与编辑、资金筹集、概念构思。
Yayun Zuo：撰写、审稿与编辑、初稿撰写。
Fei Li：初稿撰写、概念构思。
Zhimin Xu：实验研究。
Caiyun Qiu：实验研究。
Xiong Peng：初稿撰写、资金筹集。
Jaime Pinero：撰写、审稿与编辑。
Sha Su：初稿撰写、实验研究、资金筹集。
Xinyu Wang：实验研究。
Xiaohe Zhang：初稿撰写。
未引用参考文献
Bradford, 1976; Raza, 2011.
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2023YFD1600800、2022YFD1400900）、中国科技部的科技创新合作计划（202002018）、陕西省重点科技项目（2020zdzx03-03-02）、国际原子能机构的协调研究项目（项目编号：26286）以及中国博士后科学基金（项目编号：2023M733138）的支持。
