《International Dairy Journal》：Ghee powder: Processing technologies, functional properties, and applications
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本文通过孟德尔随机化（MR）分析，揭示了戊二酰辅酶A脱氢酶（GCDH）表达与头颈癌（HNC）风险增加存在潜在因果关联，其效应部分由CX3CR1+CD14++CD16++单核细胞和CD8+CD39++CD8brT细胞介导，为HNC的精准治疗提供了新靶点。
研究背景与科学问题
头颈癌（HNC）是全球第七大常见恶性肿瘤，每年新增病例超过66万例，其五年生存率数十年来一直停滞在50%左右，是重大的公共卫生挑战。头颈癌的治疗面临巨大挑战，常因局部复发、远处转移和治疗相关并发症而变得复杂，这凸显了在理解其分子机制和改善患者预后方面需要新的方法。
近年来，蛋白质翻译后修饰（PTMs）已成为癌症标志的关键调节因子。其中，巴豆酰化（Crotonylation）作为一种相对新颖的修饰，因其在癌症生物学中的潜在作用而备受关注。巴豆酰化涉及通过“写入-擦除-读取”酶系统将巴豆酰基团添加到蛋白质（主要是组蛋白）上，以巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）为供体分子。这种修饰影响基因转录调控、细胞分化以及蛋白质活性、定位和降解等细胞过程，从而促进肿瘤发生。
孟德尔随机化（MR）是一种强大的流行病学工具，广泛用于研究遗传变异与疾病结果之间的因果关系。通过利用遗传变异作为工具变量（IVs），MR有助于最大限度地减少传统观察性研究中通常存在的偏倚，例如混杂和反向因果关系。基于巴豆酰化在癌症发病机制中的既定作用，研究人员假设影响巴豆酰化相关基因表达的遗传变异对HNC风险具有因果效应。
研究设计与方法
本研究采用两样本孟德尔随机化（Two-Sample MR）研究设计，利用表达数量性状基因座（eQTL）作为工具变量，评估巴豆酰化相关基因表达与HNC风险之间的潜在因果关系。研究流程主要包括以下几个关键步骤：
- 1.
数据来源与工具变量选择：eQTL数据来自eQTLGen联盟，HNC结局数据来自FinnGen数据库（R12_C3_HEAD_AND_NECK_EXALLC数据集，包含3,942例病例和378,749例对照）。研究筛选了与巴豆酰化相关基因显著相关的顺式eQTL单核苷酸多态性（SNPs），并进行了连锁不平衡（LD）修剪，以确保工具变量的独立性。同时，通过F统计量评估工具变量强度，排除弱工具变量偏倚。
- 2.
孟德尔随机化分析：采用逆方差加权（IVW）回归作为主要估计方法，评估巴豆酰化相关基因表达与HNC风险之间的因果关系。同时，进行敏感性分析，包括MR-Egger截距检验、Cochran’s Q检验和留一法分析，以评估异质性和多效性。
- 3.
中介分析：采用两步法中孟德尔随机化框架，评估代谢物和免疫细胞特征在GCDH与HNC风险关系中的中介作用。研究纳入了1,400种循环代谢物和731种免疫细胞特征作为潜在中介。
- 4.
验证分析：利用癌症基因组图谱（TCGA）数据库分析候选基因在HNC组织中的差异表达。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析GCDH在HNC肿瘤微环境（TME）中的细胞类型特异性表达。最后，通过定量PCR（qPCR）在头颈癌细胞系中验证GCDH的表达水平。
主要研究结果
1. 巴豆酰化相关基因与HNC风险的因果关系
通过交叉分析巴豆酰化相关基因和eQTL数据，研究确定了16个候选基因。其中，4个基因与HNC风险存在显著因果关系：
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风险增加基因：戊二酰辅酶A脱氢酶（GCDH）和短链酰基辅酶A合成酶家族成员2（ACSS2）。其中，GCDH的效应最为显著（OR = 1.203, 95% CI: 1.1090-1.3056, P < .001）。
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保护性基因：双PHD指蛋白2（DPF2）和组蛋白去乙酰化酶7（HDAC7）。
敏感性分析显示，MR-Egger截距检验未检测到方向性多效性的证据，支持了因果关系的稳健性。
2. 候选基因在HNC组织中的表达验证
TCGA数据库分析显示，GCDH、DPF2和HDAC7在肿瘤组织中的表达显著高于正常组织，而ACSS2的表达则呈中度下调。值得注意的是，GCDH是唯一一个其MR推断的因果效应（风险增加）与其在肿瘤中的表达模式（上调）一致的基因，因此被选为后续机制研究的首要候选基因。
3. 代谢物和免疫细胞特征的中介作用
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代谢物中介分析：在1,400种代谢物中，未发现任何代谢物在GCDH与HNC风险的关系中起到显著的中介作用。尽管16α-羟基DHEA 3-硫酸盐水平显示出临界信号，但未达到统计学显著性。
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免疫细胞特征中介分析：在731种免疫细胞特征中，研究发现两个免疫细胞特征部分介导了GCDH对HNC的影响：
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CX3CR1在CD14++CD16++单核细胞上的表达（β?? = 0.067; P = .0290）。
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CD8在CD39++CD8brT细胞上的表达（β?? = 0.074; P = .0496）。
4. GCDH在HNC肿瘤微环境中的表达特征
单细胞RNA测序分析揭示了GCDH在HNC肿瘤微环境中具有空间异质性和谱系限制性表达模式。GCDH主要在恶性上皮细胞以及特定的基质/先天免疫区室（如成纤维细胞和单核细胞/巨噬细胞）中富集，而在T细胞亚群中表达水平较低。这一模式与癌症中已知的代谢重编程一致。
5. GCDH在HNC细胞中的表达上调
qPCR实验进一步验证了GCDH在头颈癌细胞系中的表达。结果显示，与正常口腔角质形成细胞（HOK）相比，鳞状细胞癌-9（SCC9）细胞中GCDH的表达显著上调，进一步证实了GCDH在HNC中的高表达。
讨论与结论
本研究通过整合孟德尔随机化分析、中介分析、单细胞测序和实验验证，揭示了GCDH作为巴豆酰化与HNC风险之间遗传联系的关键节点。研究结果表明，GCDH表达与HNC风险增加存在潜在因果关联，且该效应可能部分由特定的免疫细胞特征（CX3CR1+单核细胞和CD8+T细胞）介导。
GCDH在HNC肿瘤微环境中的异质性表达模式，特别是在恶性细胞和基质细胞中的富集，提示其在支持肿瘤细胞内在的致瘤过程以及促肿瘤基质重塑中可能发挥重要作用。这些发现为理解巴豆酰化在HNC发病机制中的作用提供了新的视角，并提示GCDH可能成为HNC一个有前景的治疗靶点，为未来的精准治疗策略提供了重要参考。
