深度学习驱动的靶向α7烟碱型乙酰胆碱受体的简约芋螺肽发现及其作用机制研究

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Deep learning-driven discovery and mechanism of action study of a minimalist conopeptide targeting α7 nicotinic acetylcholine receptor

本文介绍了一种结合深度学习、结构生物学与电生理学的高效筛选方法，成功发现并优化了靶向α7 nAChR的新型简约芋螺肽SS1及其高活性衍生物[S8R]SS1。通过冷冻电镜和计算模拟解析了其与受体的结合模式，揭示了独特的抑制机制，为肽类药物的理性设计提供了新范式。

　　

海洋生物中蕴藏着丰富的活性多肽资源，其中芋螺分泌的芋螺肽（conopeptide）因其高特异性和强效的药理活性，成为神经科学研究和药物开发的重要宝库。α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nAChR）是治疗阿尔茨海默病、精神分裂症和癌症等疾病的重要靶点，然而目前已知的靶向该受体的芋螺肽存在效力不足、序列过长、结构多样性有限等问题，且缺乏高效的研究手段来快速发现和优化新型肽配体。传统的随机筛选方法耗时费力，而现有靶向α7 nAChR的芋螺肽（如αD-VxXXB、Czon1107等）大多为含有四个半胱氨酸的经典α-芋螺毒素，其结构相似性限制了药物开发的突破。因此，开发一种能够快速从海量序列中筛选出高效、新颖且结构简约的靶向肽，并阐明其作用机制的新策略，成为该领域亟待解决的关键问题。

为解决上述挑战，研究团队在《Acta Pharmaceutica Sinica B》上发表论文，报道了一套融合深度学习（DL）、结构生物学、计算建模和电生理学的集成化研究流程。该研究利用基于ESM-2蛋白质语言模型的深度学习框架，对689个二硫键贫乏的芋螺肽进行了高效筛选，成功鉴定出新型α7 nAChR拮抗肽SS1。通过系统的结构-活性关系（SAR）研究和理性设计，对SS1进行优化，获得了活性提高约29倍的简约肽[ΔQP,S8R]SS1（IC₅₀= 49.2 nmol/L）。进一步结合冷冻电镜（cryo-EM）（分辨率3.3 ?）和计算建模，解析了[ S8R]SS1与α7 nAChR的复合物结构，揭示了其通过氢键、疏水相互作用及糖基化接触等稳定的独特结合模式，并发现受体处于关闭/脱敏的混合构象，从而阐明了其抑制机制。这项工作建立了一个从深度学习预测到实验验证的转化研究框架，为加速天然产物来源的肽类 therapeutics 的发现和优化提供了可推广的模板。

研究采用的关键技术方法主要包括：1）基于ESM-2预训练模型的深度学习分类与回归模型，用于从大量序列中预测靶向nAChRs及α7 nAChR的芋螺肽及其相对效能；2）多肽固相合成技术合成候选肽及其系列突变体；3）非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞表达系统与双电极电压钳（TEVC）技术，用于评估肽对α7 nAChR及其他nAChR亚型的抑制活性（IC₅₀测定）；4）冷冻电镜（cryo-EM）解析α7 nAChR与肽复合物的高分辨率结构；5）AlphaFold2/3 (AF2/AF3) 和分子动力学（MD）模拟用于肽结构生成、复合物模型预测与结合模式分析；6）圆二色谱（CD）用于分析肽的二级结构。数据集来源于UniProt、ConoServer及PubMed检索获得的转录组数据。

3.1. 构建深度学习辅助的肽筛选模型

研究人员为克服靶向α7 nAChR肽数据稀缺的难题，开发了包含二元分类（预测是否靶向nAChRs）和回归（预测针对α7 nAChR的效力排名）任务的深度学习模型。该模型基于ESM-2框架，通过10折交叉验证显示出优异性能（平均准确度0.904，平均斯皮尔曼相关系数0.930），证明了其从大量非经典芋螺肽中有效识别活性候选物的能力。

3.3. 肽筛选与抑制活性验证

应用训练好的模型对689个二硫键贫乏芋螺肽库进行筛选，预测出81个潜在nAChR靶向肽。从中选择排名前五的肽（ZS1, ZS2, SS1-SS3）进行合成与功能验证。电生理实验表明，SS1对hα7 nAChR介导的ACh激活电流具有最强抑制活性，因此被选为后续优化研究的先导化合物。

3.4. 通过Ala、Arg和Asp扫描探究SS1的结合模式

通过对SS1进行系统的丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）和天冬氨酸（Asp）扫描突变，结合电生理活性测试和圆二色谱分析，揭示了各个氨基酸残基在结合中的作用。关键发现包括：第5位（R5）、第6位（W6）和第8-10位（S8, R9, W10）残基对活性至关重要；将第8位丝氨酸（S8）突变为精氨酸（R）可显著增强抑制活性，推测是由于引入了正电荷增强了与受体的相互作用。

3.5. SS1作用于α7 nAChR的机制与结构-活性关系研究

基于扫描突变结果，研究人员进行了多轮理性设计，合成了包括第一代至第四代在内的数十个SS1类似物，并系统评估了其活性。结果表明，[S8R]SS1和进一步N端截短的[ΔQP,S8R]SS1活性显著提升，IC₅₀分别达到63.2 nmol/L和49.2 nmol/L。选择性实验表明，优化后的肽对α7 nAChR的选择性优于其他nAChR亚型（如α3β2, α4β2）。血清稳定性实验显示[ΔQP, S8R]SS1及其经过非天然氨基酸（如Pen）修饰的类似物稳定性得到改善。

3.6. 结合冷冻电镜和计算建模解析[S8R]SS1与α7 nAChR的结合模式

通过冷冻电镜解析了[S8R]SS1与工程化人源α7 nAChR（α7^EM）的复合物结构（分辨率3.3 ?），显示受体处于关闭状态。结合AF3预测和MD模拟优化，构建了高置信度的复合物模型。模型揭示[S8R]SS1结合于ACh的正交结合位点，其残基与受体C环和互补亚基的β片层形成广泛的氢键、盐桥和疏水相互作用（如R5与D186形成盐桥，R8与多个残基形成氢键，W6/W10与芳香残基存在堆叠等）。受体上的糖基化（NAG）也与肽的W10和C末端有相互作用。这些相互作用通过点突变（如受体上的S56A, R208A突变；肽上的Q1, W6, R9突变等）进行了验证，实验结果与模型预测高度一致，证实了结合模式的可靠性。

4. 讨论

本研究成功建立了一套从计算预测到实验验证的完整研究范式。深度学习模型有效解决了天然肽数据稀缺下的筛选难题；理性设计结合多轮优化快速获得了高活性、高选择性的简约肽抑制剂；冷冻电镜与计算生物学相结合，首次在近原子分辨率下揭示了此类简约芋螺肽与α7 nAChR的独特结合机制，发现了包括糖基参与相互作用在内的新细节。研究结果表明，深度学习与先进实验技术的结合能够显著加速天然活性肽的发现与优化进程。[S8R]SS1和[ΔQP,S8R]SS1作为新型、高效、选择性好的α7 nAChR拮抗剂，不仅为研究该受体的生理病理功能提供了有价值的工具化合物，也展示了其作为神经精神疾病治疗先导化合物的潜力。此外，该研究所建立的“深度学习-理性设计-结构解析-功能验证”一体化流程具有通用性，可推广至其他重要膜蛋白靶点的配体发现与机制研究中，为基于天然产物的创新药物研发提供了新思路和新方法。