《Metabolic Engineering》：Engineering
Escherichia coli for the production of saturated archaeal lipids
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本研究针对古菌磷脂在异源宿主中难以高效饱和的问题，通过在大肠杆菌中引入古菌醚脂合成通路，并结合来自甲烷八叠球菌的香叶基香叶酰还原酶（GGR）和铁氧还蛋白（Fd），同时过表达内源性丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）以增强辅因子再生。结果表明，该策略使约75%的古菌脂质实现部分或完全饱和，显著提升了工程菌对热激和冷激的耐受性。这项工作为复杂古菌膜脂的合成生物学改造提供了关键平台，发表于《Metabolic Engineering》。
在生命演化的长河中，古菌（Archaea）作为一类独特的单细胞生物，以其卓越的极端环境适应能力而闻名。这种适应性的关键之一在于其细胞膜脂质的特殊化学结构：古菌的磷脂由饱和的类异戊二烯链通过醚键连接至甘油-1-磷酸（G1P），而细菌和真核生物则主要使用酯键连接的脂肪酸链。这种结构差异被认为赋予了古菌膜在高温、高盐或能量限制条件下更强的稳定性。然而，如何在常见的工程宿主（如大肠杆菌）中重构并优化古菌脂质的生物合成路径，尤其是实现其类异戊二烯链的高效饱和，一直是合成生物学和代谢工程领域的挑战。
此前的研究虽已成功在大肠杆菌中引入古菌醚脂（Ether Lipids, EL）合成通路，产生如古菌甘油二醚（Archaetidylglycerol, AG）和古菌乙醇胺（Archaetidylethanolamine, AE）等脂质，但所产脂质大多仍为不饱和形式，与天然古菌膜中以饱和脂质为主的特性存在差距。虽然香叶基香叶酰还原酶（Geranylgeranyl reductase, GGR）及其电子供体铁氧还蛋白（Ferredoxin, Fd）的引入可部分实现饱和，但效率低下（如先前研究中饱和脂质占比仅约1%），且其电子传递路径的局限性尚未解决。因此，开发一种高效、完整的饱和古菌脂质生产系统，不仅对理解膜脂功能演化具有重要意义，也为构建具有增强鲁棒性的工程菌株提供了新思路。
本研究发表于《Metabolic Engineering》，作者Jiayi Jiang、Mirthe Hoekzema、Ruben Andringa、Adriaan J. Minnaard和Arnold J.M. Driessen团队以先前构建的高产古菌醚脂的大肠杆菌菌株（EL+）为基础，通过系统优化电子传递链，显著提升了古菌脂质的饱和水平。研究核心在于引入来自Methanosarcina acetivorans的GGR（MaGGR）和Fd（MaFd），并发现仅当共表达大肠杆菌内源的丙酮酸-铁氧还蛋白氧化还原酶（Pyruvate-ferredoxin oxidoreductase, PFOR）时，才能实现高效的辅因子再生和脂质还原。工程菌株在厌氧条件下培养时，约75%的古菌醚脂（包括AG和AE）被部分或完全饱和，其中完全饱和形式（EL(16H)）占比达27%。进一步的功能实验表明，携带这种混合异手性膜的工程菌株对热激（50°C处理5分钟）和冷激（-80°C储存4天）的耐受性均优于野生型菌株，凸显了饱和古菌脂质在增强膜稳定性方面的潜力。
为达成上述目标，研究团队运用了多项关键技术方法：首先，通过分子克隆将古菌脂质合成基因（包括G1PDH、GGPPS、GGGPS、DGGGPS和CarS）与饱和度调控模块（MaGGR、MaFd及EcPFOR）分别构建于兼容质粒上，并导入染色体整合了MEP/DOXP途径强化元件的大肠杆菌JM109(DE3)衍生菌株；其次，采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对脂质提取物进行定性与定量分析，以检测不同饱和程度的古菌醚脂（如EL(0H)至EL(16H)）及其相对丰度；此外，通过体外酶活实验验证了古菌CDP-archaeol synthase（CarS）对不饱和底物DGGGP的偏好性，明确了饱和步骤在脂质合成路径中的时序；最后，通过细胞生长曲线测定及热/冷激生存实验评估了工程菌株的生理特性。所有实验均设三重生物学重复，数据经GraphPad Prism进行统计学分析。
3.1. 通过过表达GGR和Fd在大肠杆菌中工程化古菌脂质饱和度
研究团队将编码MaGGR和MaFd的基因构建于pACYC质粒（称为“饱和度盒”），并导入已高产不饱和古菌醚脂的工程菌株（EL+）。脂质组学分析显示，在厌氧条件下，约15%的古菌醚脂被部分或完全饱和，而在有氧条件下未检测到饱和现象。这表明厌氧环境更利于铁氧还蛋白的还原态维持及电子传递。
3.2. 醚脂饱和度中的辅因子再生与铁氧还蛋白选择性
为提升饱和度，研究人员尝试了多种辅因子再生策略。表达NADPH-铁氧还蛋白还原酶（Fpr）或替换Fd为Synechocystis sp.来源的SynFd均未显著改善饱和水平。而共表达EcPFOR后，饱和度大幅提升至75%（其中完全饱和占27%）。进一步添加铁离子或硫胺素焦磷酸（TPP）并未增强效果，表明电子传递效率的限制主要源于Fe-S簇的组装或路径平衡问题。
3.3. DGGGP是古菌醚磷脂中CarS的底物
通过体外酶活实验，研究发现古菌CarS更偏好不饱和底物DGGGP，而对饱和形式的DphGP几乎无活性。这证实脂质饱和发生于CarS催化之后，为后续复杂古菌脂质（如四醚脂）的工程化提供了路径设计依据。
3.4. 产饱和古菌醚磷脂大肠杆菌的生长与鲁棒性
工程菌株（EL+_GGR-Fd-PFOR）在厌氧生长中最终菌密度略高于对照，且表达古菌醚脂的菌株（无论饱和与否）均表现出更强的热/冷激耐受性。对宿主自身磷脂的分析表明，古菌脂质的引入可能通过改变膜流动性而非直接调控宿主脂质组成来增强稳定性。
综上所述，本研究通过重构古菌脂质饱和度调控电路，成功实现了大肠杆菌中高效生产饱和古菌醚磷脂的目标。关键创新在于将PFOR介导的丙酮酸代谢与GGR/Fd电子传递链耦合，解决了还原力再生难题。所得工程菌株不仅为合成生物学提供了可定制的膜脂平台，还证明了古菌脂质在增强细菌环境适应性方面的应用潜力。未来，此系统可用于构建更复杂的古菌膜脂（如甘油二烷基甘油四醚，GDGTs），进而推动对生命膜系统演化与功能的研究。
