《Metabolic Engineering》：PET-FBA: A lightweight enzyme allocation and thermodynamics-constrained flux analysis approach to explore
Escherichia coli metabolic adaptation to intracellular acidification
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本研究针对酸性环境下酶活性和反应热力学可行性受损的问题，开发了PET-FBA（pH-、酶蛋白分配-和热力学约束的通量平衡分析）框架。该研究通过整合酶蛋白成本和反应吉布斯自由能变化，并引入pH依赖性酶动力学，成功模拟了大肠杆菌在不同外部pH水平下的代谢调整。研究发现，仅在动态调整pH依赖性酶动力学时，模型才能准确预测低pH厌氧条件下代谢向乳酸生产的转变，揭示了乳酸脱氢酶在酸性应激下维持NAD再生和细胞生长的关键作用。该轻量级框架为理解环境应激下的代谢响应、识别关键代谢瓶颈和指导菌株优化提供了系统方法。
酸性环境对微生物而言是严峻的挑战，它不仅会导致蛋白质失活和变性、破坏膜完整性，还会干扰必需反应的进行。对于大肠杆菌这类广泛应用的模式生物和工业菌株而言，理解其如何适应酸性环境至关重要。然而，即使外部pH呈中性，有机酸的存在也可能导致胞内pH值低至6.1，这种胞内酸化对细胞代谢施加了额外的压力，且难以监测和缓解。传统上，约束性建模方法，特别是通量平衡分析（Flux Balance Analysis, FBA），因其直接实现、基因组尺度适用性以及整合生理约束的可扩展性，已成为代谢工程的基石。但常规FBA模型在预测pH应激等复杂环境条件下的代谢响应时存在局限，尤其是难以捕捉pH对酶活性和反应热力学的动态影响。
为了更精确地模拟大肠杆菌在酸性应激下的代谢适应，研究人员开发了PET-FBA（pH-, Enzyme protein allocation-, and Thermodynamics-constrained Flux Balance Analysis）框架。这一框架扩展了基因组尺度建模，通过整合酶蛋白分配成本和反应吉布斯自由能（Gibbs Free Energy）变化，并特别引入了pH依赖性酶动力学来响应胞内酸化，从而能够模拟大肠杆菌在不同外部pH水平下的代谢调整。该研究发表在《Metabolic Engineering》期刊上。
为开展研究，作者主要应用了几个关键技术方法：首先，构建了酶蛋白分配和热力学约束的通量平衡模型（PET-FBA），其数学表述包含了稳态质量平衡、热力学可行性约束（通过二元变量确保反应方向性）以及酶蛋白分配约束（基于酶分子量和表观转换数kapp）。其次，从文献中收集了171个大肠杆菌酶的pH依赖性活性数据，并拟合pH依赖性酶活性模型（基于酶质子化模型）来调整kapp值。第三，利用eQuilibrator API和组分贡献法估算了标准反应吉布斯自由能（ΔGr'm，基于1 mM浓度），并针对不同区室（胞质、周质）和跨膜反应考虑了pH影响。此外，还通过体外实验（使用荧光蛋白融合技术）确定了胞内外pH的关系（pHin= 0.38?pHout+ 4.40）。模型验证包括与实验数据比较生长模拟以及进行计算机基因敲除分析。
2.1. 大肠杆菌的酶蛋白分配和热力学约束通量模型
研究人员扩展了传统通量平衡分析，通过纳入酶蛋白分配约束和热力学可行性，构建了PET-FBA模型。该模型通过三种机制捕捉pH对代谢的影响：反应热力学驱动力随pH变化、质子梯度影响的质子泄漏，以及pH依赖性酶活性模型（通过调整kapp影响酶蛋白分配）。统计分析显示，中心碳代谢途径的酶具有显著更高的kapp值。pH 4.0时，大多数酶（51.1%）仅保持其最适pH活性的25%，而在pH 7.5时，60.3%的酶活性超过75%。跨膜反应的ΔGr'm在pH 4.0和7.5之间显示出显著差异，标准偏差远大于胞质和周质反应。
2.2. 中性pH下的模型性能
模型基于iML1515构建，在中性pH（7.5）的厌氧和好氧条件下模拟生长。模拟结果与实验测量值高度一致，生长速率、底物消耗和产物形成均被准确预测，且模型成功捕捉到好氧生长中的乙酸生产。计算机基因敲除模拟对三个数据库（Keio、PEC、TraDIS）中必需基因的预测准确率在73.7%至84.6%之间，交集基因集的预测准确率达84.9%，表明模型能有效识别细胞生长和存活的关键代谢瓶颈。
2.3. 低pH下厌氧代谢的重构
模型预测，在低pH下细胞生长显著减少，厌氧生长速率在pH 4.0时比pH 7.5降低77.1%。特别地，在厌氧条件下，当pH低于5.5时，主要发酵产物从甲酸、乙酸和乙醇转变为乳酸。通过比较完整模型与部分变体（如仅含热力学约束或酶约束但无pH调整的模型），发现只有整合了酶约束、热力学可行性和pH效应的完整模型才能准确预测这种代谢转变。通量分布和酶蛋白分配分析表明，在低pH下，丙酮酸甲酸裂解酶（Pyruvate Formate Lyase, PFL）及乙酰辅酶A分支（Acetyl-CoA branch）的通量转向乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）。主成分分析（PCA）进一步强调了低pH厌氧条件下代谢的显著差异。
2.4. 代谢转变中发酵途径NAD再生的挽救
研究从酶蛋白可用性和能量平衡的角度分析了从PFL到LDH的代谢转变。发酵途径（包括LDH和乙酰辅酶A分支）的主要作用是在厌氧条件下再生糖酵解产生的NADH。模型模拟表明，在低pH下，糖酵解酶所需的蛋白资源增加约33.1%，而丙酮酸代谢的蛋白分配减少47.3%。由于乙酰辅酶A分支的酶蛋白效率在酸性应激下降低，大肠杆菌通过将NAD再生转向在低pH下仍保持足够活性的LDH来进行适应。这种调整使NAD产率（总NAD生成与发酵途径酶蛋白成本的比率）恢复到中性pH水平的约81.7%，而如果不发生代谢转变，则仅为26.2%。LDH敲除模拟显示生长速率降低21.6%，并与ldhA缺失突变体的实验表型一致。
2.5. 识别增强细胞生长的动力学瓶颈
通过将模型中每个酶的kapp值扰动±5倍进行敏感性分析，发现在厌氧条件下，细胞生长对糖酵解和丙酮酸代谢酶的活性下调最为敏感，尤其是在低pH下，平均生长损失更大（20.4% vs 12.7%）。LDH被发现在酸性和中性pH下均能增强细胞生长。在中性pH下，上调LDH的转换率可使发酵途径的酶蛋白成本降低60%，NAD产率提高2.9倍，生长速率提高24.8%，并改变产物谱。上调PFL的转换率也可增强生长，但不改变产物谱。在好氧条件下，细胞生长对酶活性波动的敏感性较低，表明好氧代谢对酸应激更具韧性。最有益于好氧生长的酶是葡萄糖脱氢酶（GLCDpp）和NADH脱氢酶（NADH16pp），它们是氧化磷酸化的组成部分。
PET-FBA框架通过整合决定代谢流向（方向性）的热力学可行性和决定代谢流容量（能力）的酶蛋白分配，并明确纳入pH效应，成功再现了大肠杆菌在厌氧发酵中由胞内酸化诱导的、从丙酮酸甲酸裂解酶向乳酸脱氢酶的代谢转变及相关通量重分布。该预测的成功高度依赖于从酶特异性数据推导出的pH依赖性活性模型，因为跨所有酶的统一切换率调整无法捕捉这一转变。与更复杂的代谢-表达模型（如AcidifyME）相比，PET-FBA专注于直接塑造胞内通量分布的组分，在保持计算效率的同时（基因组尺度问题求解仅需数秒），避免了对象表达数据集的严重依赖，为应激响应研究提供了一个轻量级、计算高效且机制可解释的框架。
该研究也指出了当前模型的局限性，例如依赖于整体蛋白质组可用性进行酶蛋白分配，而pH对总蛋白质组分配的影响尚不明确；此外，模型未考虑pH依赖性非生长关联维持（NGAM）能量成本的变化，这可能在酸应激下增加细胞能量需求。未来的工作可以整合跨pH条件收集的蛋白质组或转录组数据，并纳入实验确定的pH依赖性NGAM值，以进一步提高预测精度。
尽管如此，PET-FBA为在酸应激下探索代谢适应提供了一个强大的工具，它不仅增进了对微生物应激响应的基础理解，而且为在挑战性环境中设计鲁棒工业菌株提供了指导。该框架已作为Python包实现，便于广泛使用和进一步开发。
