《Protein Expression and Purification》：Novel anti-NS1 human single domain antibody from dengue infected NS1 positive patients
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登革病毒NS1蛋白单域抗体重链基因分离与表达纯化策略研究，通过从登革热患者PBMC中分离出新型全长重链可变区基因，构建pET28a(+)重组表达载体，优化包涵体溶解策略（硫酸铵-尿素-脯氨酸缓冲体系），获得高纯度可溶性抗体片段，并证实其与重组NS1蛋白的特异性结合（ΔG=-9.22 kcal/mol）。
Odedara Mitalben Bhikhabhai | Hemant Kumar
医学实验室技术系，Bapubhai Desaibhai Patel 医疗科学研究所（BDIPS），Charotar 科学与技术大学，CHARUSAT 校区，Changa，388421，古吉拉特邦，印度
摘要
黄病毒家族的病毒对全球人类健康有着显著影响。登革热病毒（DENV）作为黄病毒家族的一员，感染后会引起高烧、剧烈头痛和身体疼痛等病理症状。在某些情况下，它可能会发展成致命的严重登革热。作为免疫反应的关键支柱，机体会产生针对登革热蛋白不同表位的抗体，并通过靶向关键蛋白产生集体免疫反应。目前尚需开发针对登革热的疫苗，因此新型抗体迫在眉睫。在我们的研究中，我们从 NS1 阳性 DENV 感染者的外周血单核细胞（PMBC）中分离出了新的全长重链可变区基因。测序结果表明，这些分离出的重链是全新的、尚未被报道过的。经过验证的克隆被亚克隆到表达载体 pET-28a(+) 中，以便在 大肠杆菌 中表达蛋白质。选定的重链经过过表达和纯化，纯化后的重链可变区通过竞争性抑制 ELISA、剂量依赖性竞争性抑制 ELISA 和 Western blotting 确认了其与 rNS1 的特异性结合。ITC 进一步证实了 rNS1 与 SdAb3 之间的结合，其自由能变化为 ΔG = ?9.22 kcal/mol。通过抗 His 抗体通过 Western blotting 验证了纯化蛋白的身份。研究发现，大量纯化蛋白进入了不溶性部分，因此优化了使用不同缓冲液条件进行蛋白重折叠的策略。含有精氨酸、组氨酸和蔗糖的缓冲液在从不溶性部分中溶解蛋白方面最为有效。
引言
黄病毒家族包括导致登革热、寨卡病毒病、西尼罗河热、脑炎和黄热病等疾病的病毒。登革热病毒（DENV）属于正黄病毒家族，每年在亚洲、非洲和美洲导致数百万人患病。根据世界卫生组织（WHO）的估计，2024 年全球共报告了 1410 万例登革热病例，创历史新高，导致 9708 人死亡（WHO, 2024）。DENV 有 4 种主要血清型（DENV1-4），这些血清型均可引起疾病和感染。对这四种血清型的免疫具有复杂性：首先，对一种血清型的免疫并不能提供对其他血清型的保护 [1]；其次，后续感染另一种血清型可能会由于交叉反应而引发不良反应。这一现象成为开发针对所有血清型疫苗的障碍 [2]。Dengvaxia 是唯一获许可的疫苗（一种嵌合黄热病-登革热四价疫苗），但其效果有限，仅适用于有 DENV 感染史的儿童。否则，接种 Dengvaxia 后如果儿童再次感染登革热，风险会增加 [3]。这种接种后出现严重不良反应的矛盾现象目前尚无明确解释。一个合理的解释是抗体依赖性增强（ADE）现象 [4]。DENV 的非结构蛋白 1（NS1）和包膜蛋白在登革热病理过程中起着重要作用。这两种蛋白已被证实可作为诊断和治疗的目标。包膜蛋白是通过核酸扩增测试（NAAT）进行诊断的主要目标，而 NS1 则用于侧向流动测定和酶联免疫吸附测定（ELISA）[5,7]。
单域抗体（SdAb）是由单个可变区组成的抗原结合片段，包括骆驼科动物的 VHH、鲨鱼的 VNAR 以及人类或小鼠的 VH/VL 结构域（图 1）[8]。与传统单克隆抗体相比，SdAb 具有多种优势：体积更小、更容易生产、能更有效地穿透组织、能够到达隐藏的表位，并且能更高效地穿过血脑屏障 [9]。基于这些特性，它们被用于癌症治疗（包括 CAR-T 疗法）以及神经系统和传染性疾病的研究 [10]。通过基因工程，SdAb 还可以制备成双特异性或多价形式。由于它们的重要性，市场上已有商用的人类 SdAb 文库用于支持药物发现。目前尚未在人类中发现天然 SdAb，但在某些疾病患者的血清中观察到了游离轻链和游离单域重链 [11,12]。在治疗方面，单域抗体也存在一些缺点，例如它们会被肾脏迅速清除，导致半衰期较短；此外，它们缺乏 Fc 介导的免疫功能，如抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）[13]。许多商业机构已经建立了单域抗体平台用于药物发现（例如 Crescendo Biotech）。
在这项研究中，我们使用了 NS1 阳性的登革热血液样本，成功分离出了编码全长重链可变区的基因，并将其克隆到 pET-28a(+) 表达载体中。我们制备了一个这样的克隆库，并对其中的一些序列进行了表征。最初选择了三个序列进行表达和纯化。纯化的可溶性蛋白通过竞争性抑制 ELISA 测试了其与 NS1 的结合能力。其中一个结合蛋白在大规模表达后进一步纯化，以从不溶性部分中重新折叠。在重折叠实验中测试了三种不同的方法，发现其中一种方法能够获得更好的重折叠蛋白产量。
试剂
限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶购自 NEB（New England Biolabs）。dNTPs、Taq DNA 聚合酶、pMD20 T-载体、Trizole 试剂、蛋白质梯度（产品编号 #3452, #3450）和 DNA 梯度（产品编号 #DT1801.100）购自 Takara India Pvt Ltd。Revert Aid 第一链 cDNA 合成试剂盒（产品编号 K1691）购自 Thermo Fisher Scientific。重组 NS1（DENV2）购自 Abcam（产品编号 ab181966）。QUALISA 登革热 NS1 试剂盒（产品编号 #404080096）和 HRP 结合的单克隆抗体购自 ACROBiosystems。
重组表达质粒 pET28a(+) SdAb 的构建
从 PBMC 中提取总 RNA（图 2A），并将其用于 cDNA 的合成。所得 cDNA 作为模板，使用特异性引物通过 PCR 扩增重链可变区（图 2B–SI 表 1）。PCR 扩增产物被克隆到 T-载体 pMD20（Takara India，产品编号 6028）中。阳性克隆通过测序和双酶切（图 2C）进行验证。为了将片段克隆到 pET28a(+) 中，使用含有 NcoI 和 XhoI 限制位点的引物进行扩增。
讨论
人类患者体内的抗登革热抗体是对登革热病毒免疫反应的结果，这些抗体针对病毒的重要蛋白。登革热中的两个主要免疫靶点是包膜蛋白和 NS1。针对这两种蛋白的抗体反应会产生两种后果：抗体依赖性增强（ADE）和登革热休克综合征（DSS）。针对膜蛋白和包膜蛋白的抗体会导致 ADE，而针对 NS1 的抗体则被认为与 DSS 有关 [27,28]。相关研究非常有限。
CRediT 作者贡献声明
Odedara Mitalben Bhikhabhai：撰写 – 审稿与编辑、撰写原始草稿、数据可视化、方法验证、实验设计、数据分析、形式分析。
Hemant Kumar：撰写 – 审稿与编辑、撰写原始草稿、数据验证、实验监督、资源协调、数据分析、概念构建。
致谢
我们衷心感谢 Charotar 科学与技术大学 提供的研究支持和设施。本项工作未获得任何资助。Odedara Mitalben Bhikhabhai 女士感谢 UGC 提供的 Savitribai Jyotirao Phule 女童博士奖学金。我们感谢 Janesh Kumar 博士在 ITC 实验中的帮助，同时感谢 R. Phanindranath 博士和 Shiv Pratap Singh Yadav 博士在 ITC 实验装置设置方面的协助。
