《Protein Expression and Purification》：Comparative biophysical and functional analysis of TCZ-UFRJ, a potential biosimilar to Actemra
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本研究对比分析原研药托珠单抗与生物类似药TCZ-UFRJ的结构和功能，通过质谱确认序列完整性，圆二色光谱显示相似二级结构（β-折叠），荧光证实三级结构正确，质量分析显示分子量一致，糖基化位点相同且主要糖型一致。动态光散射表明无聚合体，LSPR结合实验验证IL-6受体结合能力，细胞功能实验证实生物活性，为后续临床前和临床试验奠定基础。
桑克莱弗·科雷亚·阿劳霍（Sanclayver Corrêa Araújo）|费德里科·弗朗西斯科·马尔西利（Federico Francisco Marsili）|雷娜塔·吉马良斯·阿尔维姆（Renata Guimar?es Alvim）|卡蒂亚·玛丽亚·多斯桑托斯·卡布拉尔（Katia Maria dos Santos Cabral）|埃伊托尔·阿方索·德保拉·内托（Heitor Affonso de Paula Neto）|伊莱玛·科代罗（Yraima Cordeiro）|马西乌斯·达席尔瓦·阿尔梅达（Marcius da Silva Almeida）|莱达·多斯雷伊斯·卡斯特利奥（Leda dos Reis Castilho）|雷纳托·桑帕约·卡瓦略（Renato Sampaio Carvalho）
巴西里约热内卢联邦大学（Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ）药学院，药物生物技术系
摘要
随着许多参考药物的专利到期，生物类似抗体在制药市场中的重要性日益增加。本研究对比分析了原研药物托珠单抗（tocilizumab，用于治疗类风湿性关节炎等炎症性疾病）与生物类似物TCZ-UFRJ，后者是在HEK293细胞中生产的。研究内容涵盖了多个方面，包括一级结构、二级结构、三级结构、完整质量分析、糖基化模式，以及使用IL-6敏感的THP-1细胞系和配体结合试验进行的功能测试。LC-MS肽图谱分析显示TCZ-UFRJ和Actemra的氨基酸序列完全一致，证实了其生物类似物的身份。两种抗体的二级结构相似，具有特征性的β-折叠片层结构（通过圆二色性测定）。内在色氨酸发射荧光谱证实了这两种单克隆抗体的三级结构正确折叠。完整质量分析显示它们的分子质量和糖基化形式相似。糖基化分析发现两者具有相同的糖基化位点，并且都含有主要的N-糖链。动态光散射分析表明样品为单分散状态，无寡聚体存在。LSPR配体结合试验证实TCZ-UFRJ能与IL-6受体结合，显示出特异性亲和力。在IL-6敏感的THP-1细胞系中的功能测试验证了TCZ-UFRJ的生物活性，证明了其作为生物类似物的潜力。这些初步结果表明TCZ-UFRJ有望成为Actemra的生物类似物，但还需要进一步的全面研究，包括非临床和临床试验，以确定其安全性、有效性以及与原研药物的总体相似性。
引言
生物类似抗体在制药市场中的重要性日益凸显，应用范围从癌症和炎症性疾病扩展到家族性高胆固醇血症和偏头痛等新兴领域[[1], [2], [3]]。在炎症性疾病中，类风湿性关节炎通常在晚期使用单克隆抗体治疗，如阿达利姆单抗（adalimumab）、赛妥珠单抗 pegol（certolizumab pegol）、戈利木单抗（golimumab）、英夫利昔单抗（infliximab）和托珠单抗（tocilizumab）。这些药物大多通过阻断肿瘤坏死因子-α（TNF-α）发挥作用[[4]]。赛妥珠单抗靶向淋巴细胞上的CD20蛋白[[5]]，而托珠单抗则阻断白细胞介素-6（IL-6）的膜结合型和可溶性形式[[Abou-Auda; Sakr, 2010]]。除赛妥珠单抗 pegol外，所有这些生物制剂都有相应的生物类似物。对于低收入和中等收入国家而言，生物类似物是原研产品的关键替代品[[6]]。在巴西等国家，政府在确保公众获得药品方面发挥着核心作用，无论是通过采购[[7,8]]还是自行生产[[9]]以供应公共卫生系统[[10]]。
原研产品的监管批准通常基于临床研究结果，而生物类似物的批准则侧重于结构比较，要求它们是“高度相似的产品”[[11]]。这些抗体属于IgG结构，由两条轻链和两条重链组成，形成异四聚体球状蛋白。轻链包含恒定区（CL）和可变区（VL），重链包含三个恒定区（CH1、CH2和CH3）和一个可变区（VH）。非共价相互作用和二硫键维持了球状结构的稳定性。值得注意的是，CH2区域的糖基化位点允许异质糖链的附着，这种翻译后修饰有助于提高稳定性、延长半衰期并防止单克隆抗体降解[[12]]。此外，这些糖链在抗体活性中起着关键作用，包括抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）[[13], [14], [15]]。除了ADCC和CDC，单克隆抗体还通过拮抗和信号传导机制发挥作用。单克隆抗体的糖基化过程需要在能够引入这些翻译后修饰的表达系统中进行生产。目前最常用的表达系统是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，其次是NS0和Sp2/0细胞。也有研究探索使用工程烟草植物细胞生产单克隆抗体[[16], [17], [18]]。
生物物理方法在比较生物类似物的特性方面至关重要，包括一级结构[[20,21]]、高级结构[[22], [23], [24], [25], [26]]、翻译后修饰[[28], [29], [30]]，以及杂质（如聚集物[[31,32]]和加工储存过程中产生的降解产物[[33], [34], [35]]。本研究对一种在HEK293细胞系中生产的人源化IgG1 kappa生物类似物与其在CHO细胞系中生产的原研产品进行了生物物理特性分析，重点是通过多种生物物理方法评估结构上的相似性和差异，以确保其符合批准标准。
章节片段
细胞系培养与产品纯化
TCZ-UFRJ是通过COPPE/UFRJ的细胞培养工程实验室（LECC）的稳定转染技术生产的。HEK293细胞在HEK-TF化学定义培养基（Sartorius Xell）中以每毫升100万个活细胞的浓度进行转染，使用的DNA：脂质混合物为1微克/毫升DNA和2微克/毫升Lipofectamine? 3000（Thermofisher公司）。质粒在UFRJ的分子靶标实验室设计，使得轻链和重链基因之间包含一个IRES元件。
肽图谱分析与糖基化位点鉴定
由于没有一种酶能够实现完全的序列覆盖，考虑到样品制备过程中的片段丢失[[36]]，因此需要采用多种消化方法来获得尽可能高的覆盖度。使用胰蛋白酶（Approach 1）、胰凝乳蛋白酶（Approach 2）和Lys-C（Approach 3）分别获得了Actemra 77.8%、98.2%和57.4%的氨基酸序列覆盖度。对于TCZ-UFRJ，重链（HC）的序列覆盖度分别为89.6%、95.2%。
结论
TCZ-UFRJ的一级结构分析覆盖度超过100%。二级结构分析显示存在β-折叠片层，三级结构分析表明其空间排列的色氨酸符合天然IgG的特征。基于质谱的分子质量测定显示存在多种糖基化形式。鉴定出六种糖基化形式，并确定了CH2区域的糖基化位点。
作者贡献声明
桑克莱弗·科雷亚·阿劳霍（Sanclayver Corrêa Araújo）：撰写 – 审稿与编辑，原始草稿撰写，方法学设计，实验研究，数据分析。费德里科·弗朗西斯科·马尔西利（Federico Francisco Marsili）：方法学设计，实验研究，数据分析。雷娜塔·吉马良斯·阿尔维姆（Renata Guimar?es Alvim）：方法学设计，实验研究，数据分析。卡蒂亚·玛丽亚·多斯桑托斯·卡布拉尔（Katia Maria dos Santos Cabral）：撰写 – 审稿与编辑，方法学设计，实验研究，数据分析。埃伊托尔·阿方索·德保拉·内托（Heitor Affonso de Paula Neto）：撰写 – 审稿与编辑，方法学设计，实验研究，数据分析。
致谢
作者感谢CEMBIO/UFRJ生物质谱中心提供的质谱分析支持，感谢UFRJ药物生物技术实验室提供的SEC分析支持，以及来自巴西资助机构FAPERJ、CNPq和Capes的财政支持。
