《Cellular Oncology》：TRIM47-facilitated PLK1 stabilization promotes the proliferation of liver cancer cells
编辑推荐：
为解决肝癌（LC）治疗选择有限、预后差的问题，研究人员开展了关于TRIM47在肝癌中作用机制的研究。该研究首次揭示TRIM47通过催化PLK1的K63泛素化修饰，稳定PLK1蛋白并激活NF-κB和MAPK通路，从而促进肝癌细胞增殖。该研究不仅阐明了TRIM47/PLK1轴在肝癌发生发展中的关键作用，也为肝癌的靶向治疗提供了新的潜在靶点。
肝癌（Liver Cancer, LC）是全球范围内癌症相关死亡的主要原因之一，其中肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是最主要的病理亚型。尽管手术切除和肝移植是早期肝癌的主要治疗手段，但由于早期症状不明显，大多数患者在确诊时已处于中晚期，错失了手术时机。虽然索拉非尼和仑伐替尼等靶向药物以及免疫检查点抑制剂（如PD-1/PD-L1抑制剂）在晚期肝癌治疗中取得了一定进展，但总体疗效有限，患者生存期延长有限。因此，深入探索肝癌发生发展的分子机制，寻找新的治疗靶点，对于改善肝癌患者预后至关重要。
三结构域蛋白（Tripartite motif, TRIM）家族是一类具有E3泛素连接酶活性的蛋白质，在细胞免疫、抗病毒防御和肿瘤发生中扮演着重要角色。TRIM47作为该家族的典型成员，近年来在多种癌症中被发现高表达，并作为原癌基因通过调控关键蛋白的泛素化修饰参与肿瘤进展。然而，TRIM47在肝癌中的具体功能和分子机制尚不明确。
另一方面，Polo样激酶1（Polo-like kinase 1, PLK1）是一种在细胞周期调控、凋亡和肿瘤发展中发挥关键作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。PLK1在包括肝癌在内的多种恶性肿瘤中高表达，并能通过激活PI3K-AKT、NF-κB和MAPK等经典通路促进肿瘤发展。尽管PLK1抑制剂在临床前研究中显示出良好的抗肿瘤活性，但其在临床应用中仍面临挑战。因此，深入了解PLK1的调控机制，特别是其翻译后修饰，对于开发有效的治疗策略具有重要意义。
为了回答这些问题，研究人员在《Cellular Oncology》上发表了一项研究，旨在阐明TRIM47在肝癌中的生物学功能及其调控PLK1的分子机制。该研究通过生物信息学分析发现TRIM47在肝癌组织中显著高表达，且与患者不良预后相关。功能实验证实TRIM47通过促进细胞周期进程和抑制凋亡来驱动肝癌细胞增殖。机制上，研究首次揭示TRIM47作为一种E3泛素连接酶，直接与PLK1相互作用，并催化其发生K63连接的泛素化修饰，从而稳定PLK1蛋白，进而激活NF-κB和MAPK信号通路。该研究不仅揭示了TRIM47/PLK1轴在肝癌进展中的关键作用，也为肝癌的靶向治疗提供了新的潜在靶点。
为了开展这项研究，作者主要运用了以下关键技术方法：首先，利用公共数据库（如TCGA、CPTAC）分析TRIM47在肝癌组织中的表达及临床相关性；其次，通过慢病毒介导的基因敲低和过表达技术，在体外（Huh7、HepG2、Hep3B细胞系）和体内（裸鼠皮下移植瘤模型）验证TRIM47的生物学功能；第三，采用酵母双杂交筛选、免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down实验，鉴定并验证TRIM47与PLK1的直接相互作用；第四，通过泛素化实验和蛋白稳定性检测，阐明TRIM47对PLK1的K63泛素化修饰及稳定作用；最后，利用小分子抑制剂（如PLK1抑制剂Volasertib、NF-κB抑制剂BAY-11-7082）进行挽救实验，验证TRIM47/PLK1轴在肝癌进展中的关键作用。
2.1 TRIM47在人类HCC组织中表达上调
为了评估TRIM47在肝细胞癌（HCC）中的相关性，研究人员首先利用公共蛋白质组学和转录组学数据库分析了其表达情况。分析结果显示，TRIM47在肝癌组织中的蛋白和mRNA水平均显著高于正常肝组织。值得注意的是，TRIM47的mRNA水平与晚期肿瘤分期和淋巴结转移呈正相关。Kaplan-Meier生存分析表明，TRIM47高表达与HCC患者较短的总生存期相关。这些结果表明，TRIM47在肝癌中高表达，且与患者的不良预后密切相关。
2.2 TRIM47促进LC细胞增殖
为了研究TRIM47在肝癌中的致癌作用，研究人员在体外检测了其对细胞增殖和锚定非依赖性生长的影响。通过慢病毒介导的基因敲低和过表达实验，研究人员发现，敲低TRIM47显著抑制了肝癌细胞的增殖、集落形成和软琼脂集落形成能力；而TRIM47过表达则表现出相反的效果。这些结果共同表明，TRIM47在体外对肝癌细胞具有促增殖功能。
2.3 TRIM47在体内促进肿瘤生长
为了研究TRIM47在体内肝癌发生中的作用，研究人员建立了稳定敲低或过表达TRIM47的HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤模型。体内实验结果显示，敲低TRIM47显著抑制了肿瘤的形成和生长，并降低了增殖标志物PCNA和Ki67的表达；而TRIM47过表达则显著促进了肿瘤的生长，并上调了PCNA和Ki67的表达。这些结果共同证明，TRIM47在体内对肝癌的生长具有关键的促进作用。
2.4 TRIM47敲低诱导LC细胞G2/M期阻滞并促进凋亡
鉴于恶性肿瘤中细胞增殖失调通常与细胞周期异常和凋亡抵抗相关，研究人员进一步探讨了TRIM47对细胞周期和凋亡的影响。流式细胞术分析显示，敲低TRIM47导致肝癌细胞周期阻滞在G2/M期，并上调了周期蛋白依赖性激酶抑制剂p27的表达；而TRIM47过表达则减少了G2/M期细胞比例，并下调了p27的表达。此外，Annexin V/PI凋亡检测和TUNEL染色结果显示，敲低TRIM47显著促进了肝癌细胞的凋亡，并上调了促凋亡蛋白p53和BAX的表达，下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达；而TRIM47过表达则表现出相反的效果。这些结果共同表明，TRIM47通过缩短细胞周期和抑制凋亡来促进肝癌细胞的增殖。
2.5 TRIM47直接与PLK1相互作用
为了阐明TRIM47发挥作用的分子机制，研究人员通过酵母双杂交筛选和生物信息学分析，将PLK1鉴定为TRIM47的候选相互作用蛋白。酵母双杂交实验、免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down实验均证实了TRIM47与PLK1之间存在直接相互作用。免疫荧光共定位和亚细胞分离实验显示，TRIM47和PLK1在细胞核和细胞质中共定位。通过构建截短体突变体，研究人员进一步确定了TRIM47的RING结构域（1-80 aa）和PLK1的激酶结构域（1-310 aa）是两者相互作用的关键区域。
2.6 TRIM47通过介导K63连接的泛素化稳定PLK1
鉴于TRIM47是一种E3泛素连接酶，研究人员进一步探讨了其对PLK1蛋白水平、泛素化状态和分子机制的影响。研究发现，TRIM47的表达水平与PLK1的蛋白水平呈显著正相关。蛋白稳定性实验显示，敲低TRIM47加速了PLK1蛋白的降解，而TRIM47过表达则延长了PLK1蛋白的半衰期。泛素化实验进一步揭示，TRIM47过表达能够增强PLK1的泛素化水平，且这种作用依赖于TRIM47的RING结构域。通过使用七种不同的泛素突变体，研究人员发现TRIM47特异性介导了PLK1的K63连接的多聚泛素化，而非K48连接或其他类型的泛素链。这些结果共同表明，TRIM47通过催化PLK1的K63连接泛素化，从而稳定PLK1蛋白。
2.7 NF-κB和MAPK通路介导TRIM47诱导的LC增殖
为了探究TRIM47促进肝癌增殖的下游信号通路，研究人员检测了其对NF-κB、PI3K-AKT和MAPK信号通路的影响。Western blot结果显示，TRIM47的表达水平与p65和p38的磷酸化水平呈正相关，表明TRIM47能够激活NF-κB和p38/MAPK通路。在TRIM47过表达的肿瘤组织中，p65和p38的磷酸化水平也显著升高。此外，使用PLK1特异性抑制剂Volasertib处理肝癌细胞后，p65和p38的磷酸化水平显著降低。为了进一步验证这些通路的作用，研究人员使用小分子抑制剂（AZD6244、AZD5363和BAY-11-7082）处理TRIM47过表达的肝癌细胞，结果发现，NF-κB抑制剂BAY-11-7082和MAPK抑制剂AZD6244能够有效逆转TRIM47的促癌作用，其中BAY-11-7082的效果最为显著。这些结果表明，NF-κB和MAPK信号通路在TRIM47诱导的肝癌增殖中发挥了关键作用。
2.8 TRIM47以PLK1依赖的方式促进LC细胞增殖
为了确定TRIM47的致癌作用是否依赖于PLK1，研究人员进行了挽救实验。结果显示，在TRIM47敲低的肝癌细胞中，外源性过表达PLK1能够显著逆转TRIM47敲低导致的细胞增殖抑制、集落形成能力下降和锚定非依赖性生长能力减弱。这些结果共同表明，TRIM47主要通过调控PLK1来促进肝癌细胞的增殖。
2.9 抑制PLK1活性可抵消TRIM47驱动的体内LC增殖
为了验证TRIM47/PLK1轴在体内的作用，研究人员在裸鼠皮下移植瘤模型中进行了PLK1抑制剂（GSK461364）的干预实验。结果显示，TRIM47过表达显著促进了肿瘤的生长，而PLK1抑制剂处理则有效逆转了TRIM47过表达导致的肿瘤生长加速。分子分析显示，PLK1抑制剂处理降低了TRIM47过表达肿瘤中增殖标志物（PCNA、Ki67）和周期蛋白（Cyclin D1）的表达，同时逆转了凋亡相关蛋白（Bcl-2、BAX、p53）的表达变化。这些结果共同证明，PLK1是TRIM47的下游靶蛋白，在TRIM47介导的肝癌移植瘤生长中发挥着关键作用。
3 讨论
本研究首次系统地阐明了TRIM47在肝癌中的致癌作用及其分子机制。研究证实，TRIM47作为一种E3泛素连接酶，通过催化PLK1的K63连接泛素化，从而稳定PLK1蛋白，进而激活NF-κB和MAPK信号通路，最终促进肝癌细胞的增殖。该研究不仅揭示了TRIM47/PLK1/NF-κB信号级联在肝癌进展中的关键作用，也为肝癌的靶向治疗提供了新的潜在靶点。
值得注意的是，本研究还发现，PLK1的抑制剂Volasertib能够有效逆转TRIM47过表达导致的肿瘤生长加速，这为临床治疗提供了重要的理论依据。尽管PLK1抑制剂作为单一疗法在临床应用中面临挑战，但将其与TRIM47抑制策略联合应用，可能成为治疗肝癌的一种有前景的新选择。
此外，研究还发现，PLK1的抑制剂能够降低TRIM47在翻译和转录水平的表达，提示TRIM47可能是PLK1的下游基因。这表明TRIM47和PLK1的表达可能相互促进，形成一个正反馈环路，从而进一步增强肝癌的恶性生物学行为。这一发现为理解肝癌的恶性进展提供了新的视角，值得进一步深入研究。
