DNA引导限域生长双金属纳米簇构建多酶集成纳米平台及其在生物传感与环境修复中的应用

《Advanced Composites and Hybrid Materials》：DNA-guided confined growth of bimetallic nanoclusters for constructing a multienzyme-integrated nanoplatform

为解决DNA模板金属纳米簇(DNA-MNCs)催化性能研究不足及单酶功能局限的问题，研究人员开展了DNA引导Au/Pt双金属纳米簇(DNA-Au/Pt)的合成与性能研究。该研究成功构建了兼具过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和漆酶(LAC)活性的多酶集成纳米平台，实现了对miRNA的超灵敏检测及对有机污染物孔雀石绿(MG)的高效降解，为多功能纳米酶的设计与应用提供了新策略。

在生物医学和环境科学领域，模拟天然酶功能的纳米酶因其高稳定性和可设计性而备受关注。其中，DNA模板金属纳米簇(DNA-MNCs)作为一种独特的纳米材料，凭借其优异的荧光性能和生物相容性，在生物传感领域取得了显著进展。然而，当前研究大多聚焦于其光学特性，对其内在的催化性能，特别是多酶协同催化能力的探索尚不充分。此外，传统的单功能纳米酶难以满足复杂应用场景的需求，如何构建集多种酶活性于一体的多功能纳米平台，并实现其性能的精准调控，是当前纳米酶研究面临的关键挑战。

针对上述问题，中国农业大学许文涛教授和朱龙蛟教授团队在《Advanced Composites and Hybrid Materials》上发表了一项创新性研究。该研究通过DNA引导的限域生长策略，成功构建了Au/Pt双金属纳米簇(DNA-Au/Pt)，系统揭示了其多酶模拟活性及催化机制，并开发了其在生物传感和环境修复中的创新应用。

为开展此项研究，作者团队主要采用了以下关键技术方法：首先，通过化学还原法合成了DNA-Au/Pt双金属纳米簇，并利用高分辨透射电镜(HRTEM)、X射线光电子能谱(XPS)和傅里叶变换红外光谱(FTIR)等手段对其形貌、元素组成及金属-配体相互作用进行了表征。其次，通过稳态动力学分析、自由基捕获实验和电子顺磁共振(EPR)技术，系统评估了其过氧化物酶样(POD-like)活性及催化机制。最后，基于DNAzyme的切割特性，构建了自反馈DNAzyme马达(SDM)用于miRNA检测，并利用液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析了其对有机污染物孔雀石绿(MG)的降解产物及路径。

2.1 DNA-Au/Pt的合成

研究人员首先优化了DNA-Au/Pt的合成方法。通过比较化学还原法、紫外照射法和高温加热法，发现化学还原法合成的DNA-Au/Pt纳米簇具有最高的催化活性，其活性分别是无DNA模板合成的Au/Pt纳米颗粒的19倍和单金属纳米簇的16倍。这表明DNA模板不仅为金属离子的成核提供了位点，还起到了稳定纳米簇、防止其聚集的关键作用。此外，合金效应也是提升催化活性的重要因素，Au和Pt之间的电子相互作用优化了纳米簇的电子结构，从而增强了其催化性能。

2.2 DNA-Au/Pt的表征

通过高分辨透射电镜(HRTEM)和动态光散射(DLS)分析，证实DNA-Au/Pt为平均粒径3-4 nm的球形纳米颗粒，具有良好的分散性。X射线衍射(XRD)和X射线光电子能谱(XPS)结果证实了Au/Pt合金的成功形成，且金属主要以Au⁰和Pt⁰的形式存在。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析表明，Au³⁺和Pt²⁺主要通过胞嘧啶(C)碱基的N(3)和O(2)位点与DNA模板结合，形成了稳定的螯合结构，从而实现了金属纳米簇的限域生长。

2.3 DNA-Au/Pt纳米酶的POD样催化性能

稳态动力学研究表明，DNA-Au/Pt纳米酶对H₂O₂的米氏常数(K_m)为0.26 mM，远低于辣根过氧化物酶(HRP)，表明其对H₂O₂具有极高的亲和力。自由基捕获实验和电子顺磁共振(EPR)分析证实，在催化过程中主要生成了超氧阴离子自由基(O₂^·-)。XPS分析进一步揭示了催化机制：H₂O₂在氧空位(O_v)处被吸附和活化，Au⁰向Pt⁶⁺提供电子，促进H₂O₂裂解生成O₂^·-，同时TMB被氧化为蓝色产物oxTMB。这种高效的电子转移机制是DNA-Au/Pt具有优异POD样活性的关键。

2.4 DNA对DNA-Au/Pt纳米酶催化活性的影响

研究人员系统研究了DNA模板序列和结构对催化活性的影响。结果表明，富含胞嘧啶(C-rich)的序列是合成高活性Au/Pt纳米簇的有效成核模板，其活性顺序为PolyC > PolyA ≈ PolyG > PolyT。此外，催化活性与DNA模板的长度密切相关，过长的模板或含有多个成核位点的结构会导致纳米簇聚集，从而降低其分散性和催化活性。值得注意的是，外源性互补DNA的加入对DNA-Au/Pt纳米酶的活性影响甚微，证明了其优异的化学稳定性。

2.5 基于DNA-Au/Pt纳米酶生物传感器的miR-21检测

基于DNA模板长度与催化活性的密切关系，研究人员设计了一种自反馈DNAzyme马达(SDM)用于miRNA的超灵敏检测。该策略利用目标miRNA激活被“锁定”的DNAzyme，使其在磁珠表面行走并循环切割底物链，从而产生大量短链DNA产物。这些短链产物作为高效模板合成DNA-Au/Pt，其催化活性与目标miRNA的浓度成正比，最终通过比色法实现信号输出。该传感器对miR-21的检测限低至0.2 pM，并具有良好的特异性，能够准确区分单碱基突变的miRNA。

2.6 DNA-Au/Pt的多酶模拟活性

除了POD样活性，DNA-Au/Pt还表现出过氧化氢酶样(CAT-like)和漆酶样(LAC-like)活性。研究发现，DNA-Au/Pt能够催化H₂O₂分解产生O₂，并利用O₂作为电子受体氧化2,4-二氯苯酚(2,4-DP)等底物。基于此，研究人员构建了CAT-LAC双酶级联催化系统，用于降解有机污染物孔雀石绿(MG)。实验结果表明，在H₂O₂存在下，DNA-Au/Pt能够高效降解MG，其降解过程主要涉及O₂^·-的生成。液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析证实，MG被降解为低毒性的4-甲基氨基苯甲酸和4-二甲基氨基苯甲酸等小分子产物。

本研究成功构建了一种DNA模板Au/Pt双金属纳米簇(DNA-Au/Pt)，其POD样活性相较于无DNA模板材料提升了19倍，相较于单金属纳米簇提升了16倍。这种催化活性的显著提升主要归因于双金属协同效应和高效的电子转移机制。通过优化模板序列和结构，发现以Poly C作为成核位点时纳米酶的催化活性最强，且其活性不受外源性互补DNA的影响，表现出优异的稳定性。基于此，研究人员开发了一种创新的比色生物传感器，结合DNAzyme的切割特性，实现了对miRNA的超灵敏检测，为生物医学诊断提供了高效、精准的工具。此外，DNA-Au/Pt还展现出CAT样和LAC样活性，通过双酶级联催化高效降解了有机污染物孔雀石绿(MG)，将其转化为低毒性产物，拓展了其在环境污染控制领域的应用潜力。该工作为构建具有多酶活性和多功能应用的纳米酶催化剂提供了宝贵的指导。