《Discover Plants》：Nanopore sequencing for molecular diagnostics of plant pathogens and environmental monitoring to enhance crop health and sustainability
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本综述系统阐述了纳米孔测序（Nanopore Sequencing）作为第三代测序技术（TGST）在农业领域的革新应用。文章对比了从第一代（FGST）到第三代测序技术的演进，重点剖析了纳米孔测序在植物病毒、真菌及细菌病害的实时检测、土壤微生物组分析、灌溉水体监测及食品安全评估中的核心优势。该技术凭借其长读长、实时性、便携性及成本效益，正推动精准农业（Precision Agriculture）与可持续作物健康管理的发展。
引言：农业面临的挑战与测序技术的革新
全球农业正面临生物胁迫（如病原体）和非生物胁迫（如气候变化）的双重压力，导致作物减产和食品安全问题。据估计，全球每年因病虫害造成的粮食损失高达15%，严重威胁着小农户的生计。传统的病原体检测方法，如形态学观察和PCR，往往耗时耗力，且难以应对未知病原体或混合感染。随着测序技术的迭代，从第一代（Sanger测序）到第二代（NGS，如Illumina），再到第三代测序技术（TGST），其通量、速度和成本效益不断提升，为农业精准诊断提供了强大工具。
测序技术演进：从Sanger到纳米孔
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第一代测序技术（FGST）：以Sanger测序和Maxam-Gilbert化学测序为代表，虽然准确性高，但通量低、成本高昂，难以满足大规模基因组测序需求。
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第二代测序技术（SGST）：以Illumina、Roche 454和Ion Torrent为代表，实现了高通量、短读长测序，极大地推动了基因组学研究。然而，短读长在组装复杂基因组（如高重复序列或高杂合度区域）时存在局限，容易遗漏结构变异（SV）和重复序列。
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第三代测序技术（TGST）：以Pacific Biosciences（PacBio）的单分子实时（SMRT）测序和牛津纳米孔技术（ONT）为代表。其中，纳米孔测序通过检测单个DNA或RNA分子穿过纳米孔时引起的电流变化来直接读取序列，无需扩增步骤，实现了超长读长（可达150 kb）和实时测序。
纳米孔测序：原理与优势
纳米孔测序的核心原理是：在电场驱动下，单链DNA或RNA分子穿过纳米孔，不同碱基通过时会引发独特的电流阻断信号，从而被识别。该技术具有以下显著优势：
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长读长：能够跨越复杂重复区域，简化基因组组装，更准确地检测结构变异。
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实时性：数据产出即时，支持现场快速诊断。
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便携性：MinION等设备体积小巧，便于田间地头使用。
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直接测序：可直接对RNA进行测序，无需反转录，保留RNA修饰信息。
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成本效益：相较于其他测序平台，具有较低的测序成本。
应用一：植物病害的精准诊断
1. 病毒病检测
植物病毒是造成重大经济损失的病原体之一。纳米孔测序通过直接测序总RNA或cDNA，能够快速鉴定出引起环斑、花叶、黄化等症状的病毒。例如，在番茄上，该技术成功检测到番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）、番茄褐色皱果病毒（ToBRFV）等多种病毒。在木薯上，利用滚环扩增（RCA）结合纳米孔测序，有效鉴定了非洲木薯花叶病毒（ACMV）和斯里兰卡木薯花叶病毒（SLCMV）。其长读长特性有助于区分病毒的不同株系，为抗病育种提供精确靶点。
2. 真菌病检测
真菌病害，如由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病，是葡萄等经济作物的主要威胁。传统真菌鉴定依赖形态学和培养，耗时长且对非培养真菌无效。纳米孔测序通过对核糖体RNA操纵子（18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S）进行长片段扩增子测序，能够实现物种水平的精确鉴定。研究表明，即使在感染叶片中灰葡萄孢并非优势菌，该技术也能有效检测到其存在，并同时鉴定出其他共生的致病或非致病真菌。
3. 细菌病检测
细菌性病害，如火疫病（Erwinia amylovora）和青枯病（Ralstonia solanacearum），传播迅速，危害严重。纳米孔测序结合特异性PCR引物，可实现对细菌病原体的快速分型。例如，针对检疫性有害生物木质部难养菌（Xylella fastidiosa），开发了兼容Sanger和纳米孔测序的PCR检测方法，可在数小时内完成物种和亚种的鉴定，为口岸检疫和田间防控提供有力支持。
应用二：农业环境与栽培管理
1. 灌溉水体监测
灌溉水是病原菌传播的重要途径。利用纳米孔测序对水体中的微生物群落进行宏基因组分析，可以评估水质安全。研究发现，不同水源（溪流、水塔、泉水）的微生物群落结构存在显著差异，并检测到多种抗生素抗性基因（ARGs）。通过监测水体中的病原菌丰度，可以预警病害发生风险，指导科学灌溉。
2. 土壤质量评估
土壤微生物组是土壤健康的关键指标。纳米孔测序通过对16S rRNA或ITS区域进行扩增子测序，能够全面解析土壤细菌和真菌的群落结构。与Illumina等短读长平台相比，其长读长特性有助于提高物种分类的准确性，特别是在真菌多样性分析中。通过监测土壤微生物的动态变化，可以评估施肥、轮作等农事活动对土壤生态的影响，指导可持续土壤管理。
3. 食品安全与污染物检测
纳米孔技术不仅用于核酸测序，还可作为生物传感器用于食品中污染物的检测。通过构建功能化的生物或固态纳米孔，可以高灵敏度地检测重金属离子、农药残留、兽药残留以及食品毒素等有害物质。这种检测方法具有免标记、高灵敏度和快速响应的特点，为食品安全快速筛查提供了新策略。
挑战与展望
尽管纳米孔测序展现出巨大潜力，但仍面临一些挑战。首先，其原始读长错误率相对较高，需要结合生物信息学算法进行纠错和质控。其次，数据分析流程相对复杂，对计算资源和生物信息学技能有一定要求。此外，在田间应用时，样品的快速处理和文库构建的标准化仍需优化。
未来，随着测序化学和算法的不断改进，纳米孔测序的准确性将进一步提升。其与人工智能（AI）和机器学习（ML）的结合，将实现更智能、更自动化的病原体识别和数据分析。同时，纳米孔测序与其他组学技术（如转录组学、蛋白质组学）的整合，将为全面理解作物-微生物互作提供多维度信息，最终推动精准农业和可持续农业的发展。
