《Cellular and Molecular Life Sciences》：Evaluation of a human 3D multicellular hepatic spheroid model as a platform for studying hepatic transporters
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本研究针对现有体外肝模型在长期药物转运研究中的局限性，开发了一种全人源多细胞肝球体模型。通过整合定量靶向蛋白组学、RNA测序、免疫荧光和功能分析，系统评估了13种肝转运体在21天内的动态变化。研究发现该模型能维持胆汁酸代谢功能，并证实MRP2的活性外排功能，但存在基底侧转运体定位异常等挑战，为药物肝处置预测提供了新方法学依据。
在药物研发领域，准确预测药物在人体内的处置过程至关重要。肝脏作为药物代谢和排泄的主要器官，其功能复杂性使得体外模型的构建充满挑战。传统二维培养的肝细胞虽被广泛应用，却存在细胞去分化、缺乏非实质细胞等局限，难以模拟真实的肝脏微环境。随着三维培养技术的发展，多细胞肝球体模型应运而生，但其在肝转运体研究中的适用性仍有待系统验证。
近日发表于《Cellular and Molecular Life Sciences》的研究论文，首次对全人源多细胞肝球体模型进行了长达21天的综合评估。研究团队通过整合多种先进技术手段，揭示了该模型在肝转运体研究中的优势与局限，为药物开发提供了重要参考。
关键技术方法包括：使用转运体认证的冷冻保存原代人肝细胞与三种非实质细胞构建多细胞球体；通过定量靶向绝对蛋白组学分析13种转运体蛋白浓度；采用RNA测序研究基因调控机制；利用免疫荧光技术观察蛋白定位；通过LC-MS/MS进行胆汁酸谱分析；应用B-CLEAR?技术评估MRP2功能。
形态学与细胞活力研究显示，多细胞肝球体在21天培养期内保持稳定形态，但细胞活力存在供体特异性差异。较年长、BMI较高的供体来源细胞表现较差，提示供体选择对长期培养至关重要。
转运体蛋白浓度分析发现，与新鲜解冻肝细胞和二维培养相比，多细胞球体中多数转运体浓度显著降低，但有机溶质转运体OST-α/β和多药耐药相关蛋白MRP4表达上调，表明模型对胆汁酸积累产生了适应性反应。
转运体调控机制研究表明，鹅去氧胆酸处理可显著上调OST-α和OST-β基因表达，但未观察到胆汁盐输出泵的预期上调，提示核受体调控通路可能存在模型特异性差异。
转运体定位分析揭示了有趣的空间分布特征：钠-牛磺胆酸共转运多肽与基底侧膜标记物共定位，而OATP1B3主要位于细胞内。顶端转运体MRP2与紧密连接蛋白ZO1共定位，证实胆管网络形成，但胆汁盐输出泵主要分布于球体周边，类似代谢功能障碍相关脂肪性肝病中的分区模式。
胆汁酸谱分析显示，多细胞球体具有功能性胆汁酸合成、代谢和外排能力，但代谢物分布与二维培养存在显著差异，提示转运体介导的胆汁酸处置途径不同。
MRP2功能与紧密连接调节实验证实，多细胞球体中存在功能性胆管网络，MRP2能将底物CDF排泄到胆管腔中。然而，钙离子游离缓冲液处理后，胆管内容物无法完全清除，表明三维结构导致内容物滞留，传统B-CLEAR?技术在此模型中的定量应用受限。
研究结论强调，多细胞肝球体模型在长期肝转运体研究中展现独特价值：非实质细胞的加入增强了模型对胆汁酸应激的敏感性；尽管多数转运体蛋白表达较低，但仍保持功能活性；胆管网络形成和功能得到证实。然而，基底侧转运体定位异常、球体间变异以及胆管内容物滞留等问题仍需解决。
这项研究为理解复杂三维环境中肝转运体生物学提供了新视角，建立了多细胞球体模型表征的基准，推动了新一代肝脏模型在药理学和毒理学应用中的优化发展。通过系统评估转运体丰度、功能、调控和胆汁酸代谢，该研究为药物肝处置预测、药物相互作用风险评估以及监管决策提供了重要科学依据。
