《International Journal for Parasitology》：Uptake of
Ascaridia galli Extracellular Vesicles by Chicken Immune Cells varies according to worm sex and
in vitro culture duration
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本研究针对鸡蛔虫（Ascaridia galli）细胞外囊泡（EVs）介导宿主免疫调控的机制尚不明确的问题，通过优化体外EVs生产条件，系统评估了不同性别虫体在不同培养时间点产生的EVs被鸡免疫细胞（包括肠道上皮细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞及全血白细胞）摄取的动力学差异。结果表明，EVs摄取效率随孵育时间（4 h至24 h）显著增加，且受虫体性别和培养时间共同影响，其中24 h培养的雌虫来源EVs展现出更强的摄取偏好性。该研究揭示了虫源性EVs在宿主-病原体互作中的复杂调控网络，为理解寄生虫免疫逃避策略及开发新型防控手段提供了重要依据。
在自由放养的家禽养殖系统中，一种名为鸡蛔虫（Ascaridia galli）的寄生性线虫正悄然带来巨大的经济损失。这种寄生虫感染可导致鸡只生长迟缓、产蛋量下降，更棘手的是，它会抑制宿主的免疫系统，使鸡群更容易遭受继发感染，严重时甚至增加死亡率。尽管鸡只会对感染产生细胞和体液免疫应答，但蛔虫似乎拥有精妙的“伪装术”，能够操纵宿主免疫防御，避免被清除，从而建立慢性感染。近年来，科学家们将目光投向了寄生虫分泌的一种微小信使——细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）。这些纳米级别的囊泡如同特洛伊木马，携带蛋白质、核酸等活性物质，在宿主与病原体之间穿梭，传递信息，调控免疫反应，成为理解寄生虫致病机制的新焦点。然而，关于鸡蛔虫EVs，特别是其如何被宿主细胞识别和摄取，以及虫体自身特性（如性别）是否影响这一过程，所知甚少。为了解决这些问题，一项发表在《International Journal for Parasitology》上的研究应运而生，旨在揭示鸡蛔虫EVs的摄取规律及其影响因素。
为了深入探究鸡蛔虫EVs与宿主细胞的互动，研究人员设计了一套严谨的实验方案。他们首先从感染鸡只的肠道中收集成年鸡蛔虫，按性别分离，并在无EVs的RPMI 1640培养基中进行体外培养。在不同的时间点（18小时、24小时、40小时、48小时）收集含有EVs的培养上清液。接着，通过差速离心和尺寸排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography, SEC）分离和富集EVs。对获得的EVs，研究人员利用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）技术测定其浓度和粒径分布，通过蛋白质定量（ Bradford assay）评估纯度，并借助透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察其形态特征。为了追踪EVs的命运，研究团队使用DiO（一种亲脂性荧光染料）对EVs进行标记。随后，他们将标记好的EVs分别与鸡肠道上皮细胞系（8E11）、巨噬细胞样细胞系（HD11）、外周血单核细胞（PBMC）以及全血白细胞共培养，设定4小时和24小时两个孵育时间点。最后，综合运用流式细胞术（Flow Cytometry）和共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）这两种强大的技术手段，定量和定性地评估不同宿主细胞对EVs的摄取情况，并统计分析其与虫体性别、培养时间等因素的关系。
3.1. 鸡蛔虫EVs的分泌动力学
研究人员首先关注了鸡蛔虫分泌EVs的能力。结果发现，虫体的体型大小会影响EVs的产量，中等大小的雌虫和雄虫分泌的EVs数量最多。在培养时间方面，雌虫在培养24小时后分泌的EVs平均产量最高，但与培养48小时相比无显著差异。雄虫则在培养40小时后数值上显示出最高的EVs产量，但各时间点间的差异也不显著。通过尺寸排阻色谱分离后发现，雌虫来源的EVs主要分布在第5、6、7和8组分中，其中第6组分的EVs产量最高；而雄虫来源的EVs在所有组分中的产量均显著低于雌虫，且在第8组分中未检测到EVs。两种性别虫体分泌的EVs粒径分布相似，主要集中在100-200纳米之间。流式细胞术分析DiO标记的EVs显示，大约30%的囊泡被成功标记，且标记强度在不同性别和培养时间点间相似。有趣的是，在DiO阳性的EVs群体中，可以根据侧向散射信号区分出两个亚群，其中一个亚群（YSSChi群体）在培养24小时的雄虫来源EVs中比例更高。
3.2. 宿主细胞对鸡蛔虫EVs摄取的性别差异
研究团队系统评估了不同宿主细胞对鸡蛔虫EVs的摄取情况。在鸡肠道上皮细胞（8E11）中，孵育4小时后，各种来源的EVs摄取均很少。但当孵育时间延长至24小时，EVs摄取显著增加，尤其是来源于培养24小时雌虫的EVs，其阳性细胞比例最高。值得注意的是，在24小时培养条件下，雌虫EVs的摄取率显著高于雄虫EVs；然而，在40小时培养条件下，雄虫EVs的摄取率反而高于雌虫EVs。共聚焦显微镜对单个细胞摄取EVs荧光强度的分析进一步证实了这种随时间变化的复杂模式。在鸡巨噬细胞样细胞（HD11）中，也观察到了类似的趋势：24小时孵育后，摄取率显著高于4小时；并且，培养24小时的雌虫来源EVs诱导了最高的摄取频率，而培养40小时的雄虫来源EVs则显示出比同期雌虫EVs更高的摄取倾向。不过，在HD11细胞中，单个细胞摄取的EVs平均荧光强度在不同组别间未显示出统计学差异。
3.2.1. 鸡蛔虫EVs在鸡外周血细胞中的摄取
研究进一步扩展到原代免疫细胞。在全血实验中（仅测试4小时孵育），不同类型的白细胞表现出不同的摄取能力。其中，单核细胞（Monocytes）的EVs阳性细胞比例最高，且存在显著的性别和培养时间依赖性：24小时培养的雌虫EVs摄取率最高，而40小时培养的雄虫EVs摄取率则高于同期雌虫EVs。异嗜性粒细胞（Heterophils, 禽类中性粒细胞）也表现出中等程度的摄取，同样显示出雌虫24小时培养EVs优势，以及40小时培养雄虫EVs优势的模式。淋巴细胞（Lymphocytes）和血栓细胞（Thrombocytes, 禽类功能类似血小板）的摄取率相对较低，但也呈现出类似的性别与培养时间交互影响的趋势。在外周血单核细胞（PBMC）实验中（测试了4小时和24小时两个孵育点），所有细胞亚群在24小时孵育后的EVs摄取率均显著高于4小时。单核细胞依然是摄取最活跃的群体，其摄取模式与全血实验结果一致。B细胞和T细胞虽然整体摄取水平较低，但仍能观察到培养24小时雌虫EVs在短期（4小时）孵育下即能引起相对较高摄取的特点。共聚焦显微镜图像显示，被摄取的EVs在单核细胞和血栓细胞内常聚集在细胞核附近。
本研究清晰地表明，鸡蛔虫来源的细胞外囊泡（EVs）能够被多种鸡源宿主细胞有效摄取，且这一过程受到虫体性别、EVs收集时的培养时间以及宿主细胞类型的共同调控。延长EVs与宿主细胞的共孵育时间（从4小时到24小时）能显著提高摄取效率。特别值得注意的是，培养24小时的雌虫来源EVs在多数实验条件下表现出更强的被摄取能力，而培养时间延长至40小时后，雄虫来源EVs的摄取优势则显现出来，尽管总体摄取水平较24小时点有所下降。这种性别相关的差异提示雌雄虫体可能因其不同的生物学角色（如繁殖策略）而分泌功能特性各异的EVs，从而以不同方式影响宿主免疫环境。
该研究的发现具有多重重要意义。首先，它优化了鸡蛔虫EVs的体外生产流程，确定24小时为获得具有较强生物活性EVs的理想培养时间点，为后续功能研究提供了基础。其次，研究首次系统描绘了鸡蛔虫EVs被鸡免疫细胞摄取的图谱，揭示了单核细胞是摄取最活跃的细胞类型，这为理解寄生虫如何靶向关键免疫细胞进行调控提供了线索。此外，发现虫体性别影响EVs的摄取，开辟了从性别角度研究寄生虫-宿主互作的新视角，提示未来研究应考虑混合性别虫群以更真实地模拟体内情况。最后，这些关于EVs摄取的基本规律，为未来探索EVs所携带的具体免疫调控分子及其作用机制奠定了基础，有望为开发针对鸡蛔虫病的新型干预措施（例如基于EVs的疫苗或诊断工具）提供理论依据。总之，这项研究深化了对禽类寄生虫利用EVs进行免疫调节的理解，将宿主-病原体互作的研究推进到了细胞外囊泡这一前沿领域。
