分子开关技术结合阻断引物检测EGFR外显子19缺失突变及其在cfDNA分析中的应用研究

《Bioengineering & Translational Medicine》：Molecular switch-mediated detection of EGFR deletion mutations and its application to cfDNA analysis

本文开发了一种基于分子开关技术结合阻断引物的新方法，用于高灵敏度、高特异性检测非小细胞肺癌（NSCLC）相关的表皮生长因子受体（EGFR）外显子19缺失突变（如del E746-A750和del L747-S752 ins S）。该方法利用高保真DNA聚合酶的3′→5′外切酶活性及硫代修饰引物，在实时荧光定量PCR（qPCR）平台上实现对突变模板的特异性扩增，并能有效抑制野生型（WT）背景。研究证实该技术可显著提升对低拷贝数循环游离DNA（cfDNA）样本的突变检出率，为肺癌的早期无创诊断和个性化治疗监测提供了新策略。

　　

分子开关介导的EGFR缺失突变检测及其在cfDNA分析中的应用

摘要

表皮生长因子受体（EGFR）突变的灵敏、有效检测对于非小细胞肺癌（NSCLC）的早期筛查和诊断至关重要。本研究评估了分子开关技术结合阻断引物检测EGFR外显子19突变的灵敏度和特异性。我们证明这种新方法可以在qPCR平台上实时检测突变模板。此外，将该方法应用于循环游离DNA（cfDNA）样本可提高突变检出率。

1 引言

EGFR突变在NSCLC患者中非常普遍，是临床研究的重点。在亚洲人群中，EGFR外显子19的del E746-A750（15 bp缺失）和del L747-S752 ins S（18 bp缺失）突变约占病例的68%。检测这些突变对NSCLC患者的早期肿瘤筛查和预后评估至关重要。

目前，肿瘤组织中的突变检测通常依赖于体细胞来源的DNA样本。然而，体细胞中突变拷贝数低，有时会被样本中丰富的野生型（WT）基因所掩盖，给检测带来挑战。虽然基因测序是金标准，但其灵敏度低、耗时长、成本高，限制了其临床应用，尤其是在循环游离DNA样本中。

近年来，以血液样本中循环肿瘤DNA（ctDNA）检测为代表的液体活检技术，因其无创、操作简便、可重复采样等优点，在癌症检测中日益突出。肺癌患者原发或转移病灶中存在的EGFR基因突变可以在其循环游离DNA中检测到。在临床诊断方面，各种光学分子生物学技术应用于cfDNA样本时可实现高灵敏度和特异性，在肺癌的早期诊断、个性化治疗和预后方面具有广阔的应用前景。然而，早期肿瘤患者血液中循环游离肿瘤DNA水平通常较低，目前的检测技术可能无法有效检测突变的ctDNA。因此，迫切需要建立具有高灵敏度和特异性的突变基因新检测方法来监测肺癌患者的突变水平。

本文评估了分子开关法检测EGFR外显子19 del E746-A750（15 bp缺失）和del L747-S752 ins S（18 bp缺失）的灵敏度和特异性。分子开关法的策略是将耐核酸酶的硫代磷酸酯修饰的碱基特异性引物与具有3′→5′外切核酸酶活性的高保真DNA聚合酶相结合。高保真聚合酶分子中的聚合中心和3′→5′外切核酸酶水解中心在分子开关中以“开”和“关”的方式运作：对于配对的引物，高保真DNA聚合直接在酶的聚合中心发生；相反，对于3′末端错配的引物，其从酶的聚合中心转移到3′→5′外切核酸酶消化中心。由于修饰的3′末端具有耐核酸酶特性，这导致消化过程延长而无产物，最终因酶的聚合中心失活而使DNA聚合反应停止。

本研究选择EGFR外显子19的两个热点缺失作为检测靶点，并设计引物使其3′末端与突变位点特异性配对，同时引入磷酸盐修饰。分子开关法能够在引物与突变模板匹配时扩增突变序列，而在引物与野生型模板错配时抑制扩增。该技术被用于在实时qPCR平台上建立一种高灵敏度、高特异性的qPCR检测方法，用于检测外显子19第15和第18个碱基的缺失突变。为了提高灵敏度并减少非特异性扩增，阻断引物被进一步引入分子开关法中。这些寡核苷酸与目标突变区域的野生型序列完全互补，并在3′末端进行修饰以阻断延伸。通过结合野生型模板，阻断引物阻止了野生型序列的扩增，从而促进了目标突变片段的扩增和富集。这种阻断引物的加入优化了分子开关对低突变拷贝数样本的检测。此外，本研究中使用的分子开关证明了其在以低拷贝数为特征的游离DNA样本中进行突变检测的适用性。该方法为肺癌患者EGFR基因外显子19缺失突变的无创诊断和个性化用药监测提供了潜力。

2 材料与方法

大肠杆菌DH5α菌株购自北京天根，质粒PMD-19购自TaKaRa（大连，中国），pGEM-T简单载体购自Promega（美国麦迪逊）。血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒购自北京天根，而QIAamp循环核酸试剂盒、QIAquick凝胶回收试剂盒、MinElute PCR纯化试剂盒和QIAprep质粒小量提取试剂盒购自QIAGEN。BigDye Terminator测序试剂盒3.1购自Applied Biosystems，HotStarTaq Plus DNA聚合酶和dNTP Mix购自Qiagen。BIOMIGA提供2× Taq PCR Mix，Biotiu提供20× Eva green。Thermo Scientific的产品包括高保真DNA聚合酶、T4连接酶、100 bp DNA Ladder、1 kb DNA Ladder以及限制性内切酶SalI和XbaI。其他材料如氨苄青霉素、Tris-base、EDTA、DMSO、电泳级琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨和琼脂粉主要购自Alpha Bio Reagent。

本研究中使用的引物由上海生物工程公司（中国）合成。这些引物包括三种类型：用于野生型模板制备的引物、定点突变引物和分子开关检测引物。

2.1 野生型和突变重组质粒的构建

使用常规PCR和重叠延伸定点诱变技术与Taq DNA聚合酶构建含有WT和突变EGFR基因的质粒，所用引物详见表1。通过琼脂糖凝胶电泳使用MinElute PCR纯化试剂盒分离和纯化PCR产物。将凝胶纯化的PCR产物使用T4 DNA连接酶亚克隆到pGEM-T easy载体中。随后对克隆产物进行测序以确认其保真度。

2.2 基因组DNA样本和cfDNA样本制备

从苏州大学附属第二医院获取两份正常人血液样本。按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的方案从这些血液样本中提取基因组DNA。

从苏州大学附属第二医院和上海市肺科医院收集24例肺癌患者的手术组织样本和外周血样本。分别使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒和QIAamp循环核酸试剂盒提取组织样本中的基因组DNA和外周血中的cfDNA。

2.3 分子开关检测系统的构建

分子开关法采用高保真DNA聚合酶结合具有3′末端硫代修饰的特异性引物。表2详细列出了本研究中用于检测D15和D18突变体的分子开关引物。引物7和引物8作为具有3′末端硫代修饰的正向引物，而引物9作为未经特异性修饰的反向引物。

将阻断引物以与正向或反向引物等摩尔量加入到分子开关的PCR反应体系中。随后进行qPCR反应。

2.4 伦理声明

本研究在纳入前已在苏州大学附属第二医院医学伦理委员会注册（EC-JD20240601）。本研究中的所有患者均签署了书面同意书，所有相关调查均根据赫尔辛基宣言的原则进行。

3 结果

3.1 成功构建重组质粒

WT和突变质粒模板成功制备，如图2所示。测序证实亚克隆载体包含WT和突变片段。具体而言，WT重组质粒包含EGFR基因的外显子19序列（图2a），D15突变质粒含有EGFR基因外显子19 del E746-A750缺失突变序列（图2b），D18突变质粒含有EGFR基因外显子19 del L747-S752 ins S缺失突变序列（图2c）。

3.2 分子开关检测D15和D18突变模板的灵敏度和特异性

对D15和D18突变质粒进行10倍等浓度梯度稀释，起始质粒浓度为10⁸copies/μL，每个稀释度设三个平行管。使用突变分子开关系统对10⁸至 10¹copies/μL范围内的两种突变模板进行实时qPCR扩增。根据qPCR扩增曲线和熔解曲线评估分子开关系统检测D15和D18突变的灵敏度。分子开关能有效扩增D15型（图3a）和D18型（图3b）突变质粒，最低浓度至10¹copies/μL。为了测试分子开关对突变模板的特异性，分析了熔解曲线。熔解曲线显示，在10⁸至 10²copies/μL的拷贝浓度范围内，D15型突变质粒出现单峰，表明特异性良好。然而，在10¹copies/μL的最低浓度下，观察到非特异性条带扩增（图3c）。类似地，分子开关在10⁸至 10³copies/μL的拷贝浓度范围内对D18型突变质粒显示单峰，也表现出良好的特异性。然而，在10²和 10¹copies/μL浓度下，发生了非特异性条带扩增（图3d）。

对WT质粒进行10倍等浓度稀释，起始质粒浓度为10⁵copies/μL，每个稀释度设三个平行管。使用D15和D18突变分子开关系统对10⁵至 10¹copies/μL范围内的野生型模板进行实时qPCR扩增。通过qPCR扩增曲线、熔解曲线和Ct值评估这些突变分子开关在WT质粒检测中的扩增效率。D15和D18突变分子开关在10⁵至 10¹copies/μL的WT质粒中均表现出不完全的qPCR扩增曲线，扩增分别发生在33和29个循环之后（图4）。此外，Ct值的标准偏差超过0.25，表明准确性差（表3）。熔解曲线分析显示，D15突变分子开关在WT质粒浓度为10⁵copies/μL和10³copies/μL时各有一个管出现双峰，产物Tm为87°C，峰低且荧光值低于绿色阈值线，而其他WT质粒拷贝数显示非特异性扩增产物（Tm=78°C）（图5a）。D18突变分子开关在WT质粒浓度为10⁴和 10²copies/μL时各有一个管，在10³copies/μL时有两个管出现双峰，产生Tm为86.5°C的产物，而其余的WT质粒拷贝显示非特异性扩增产物（Tm=80.5°C）（图5b）。这些结果表明，D15突变分子开关在10⁵至 10¹copies/μL的WT质粒浓度下的qPCR检测中表现出高特异性，不易出现假阳性结果，而D18突变分子开关在此浓度范围内的特异性稍低，可能产生假阳性结果。

为了模拟更接近实际临床样本中发现的两种EGFR基因罕见缺失突变的分子环境，将基因组DNA（gDNA）与不同比例的突变模板混合。当gDNA与两种突变质粒混合时，在10⁴至 10¹copies/μL的gDNA背景下，D15和D18突变质粒的扩增曲线与标准曲线的一致性更好。在高模板浓度下主要观察到特异性产物峰，而低拷贝突变质粒则出现具有非特异性产物的双峰（图6和图7）。

对这些结果的统计分析表明，分子开关在10⁴和 10³copies/μL的gDNA背景下检测两种突变类型与标准曲线有很强的相关性（图8a,b,d,e），而在10²copies/μL的gDNA背景下检测两种突变类型的相关性较差（图8c,f）。此外，在上述所有背景下，D15型突变与标准曲线的相关性均强于D18型突变。这些结果表明，突变分子开关在基因组DNA背景下检测D15型突变表现出良好的灵敏度，最低可检测10¹copies/μL的突变分子。然而，检测D18型突变的灵敏度稍低，表明需要进一步优化以提高检测灵敏度。

为了优化分子开关技术，我们在其PCR体系中加入阻断引物后，重新测试了由gDNA和突变质粒组成的混合模板。研究表明，在10⁴copies/μL的gDNA背景下（图8a），加入阻断引物的D15突变分子开关与标准曲线的相关性比未加阻断引物的体系差；当标准对数起始量（Standard Log Starting Quantity）为3时，加入阻断引物前后的检测结果差异具有统计学意义（p < 0.05）。类似地，D18型在检测10⁴至 10²copies/μL的突变系统时与标准曲线的相关性较弱（图8d），但在检测10¹copies/μL的突变系统时相关性较强；当标准对数起始量为2至4时，加入阻断引物前后的检测结果差异具有统计学意义（p < 0.05）。在10³和 10²copies/μL的gDNA背景下（图8b,c,e,f），与未使用阻断引物时相比，使用阻断引物系统时，两种突变分子开关在低拷贝数突变分子样本中与标准曲线的相关性均有所改善；D15突变分子开关仅在10⁴copies/μL gDNA背景且标准对数起始量为1时，其检测结果在加入阻断引