《Journal of Chromatography Open》：ANALYTICAL APPROACHES FOR THE IDENTIFICATION AND QUANTITATION OF NITAZENES: A REVIEW
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本综述系统评述了高效合成阿片类药物尼塔烯的分析策略，涵盖查获材料、生物基质（死后与临床/法医）及废水等样本。文章重点介绍了基于基质的分层分析工具包，包括用于快速初筛的振动指纹图谱与常压离子化技术，以及用于选择性确证和异构体分辨的色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS/HRMS, GC-MS），并探讨了标准品稀缺、异构体干扰、免疫分析法交叉反应性等核心挑战及微采样等前沿方向。
尼塔烯是一类高效的新型合成阿片类药物，其核心结构为2-苄基苯并咪唑，允许广泛的取代，从而产生一系列具有不同药理学和理化性质的类似物。尽管它们最初在20世纪中期被开发作为吗啡的替代镇痛药，但并未进入临床使用。近年来，这类药物在非法药物市场上的出现引起了广泛关注。由于其效力极高，某些化合物的μ-阿片受体激动活性甚至比芬太尼强一个或多个数量级，导致呼吸抑制风险高、有效剂量低、安全边际窄，并且有报道称对纳洛酮治疗的反应性降低，对公共健康构成了严重威胁。
从分析化学的角度来看，尼塔烯带来了显著挑战。其不断扩展的结构多样性和新类似物的持续涌现，限制了认证参考物质和全面谱库的可用性。此外，许多类似物结构相似或存在异构现象，这在常规毒理学和法医学工作流程中使它们的区分变得复杂。分析实验室必须在多种基质中检测、识别并在需要时定量尼塔烯。可用的分析方法反映了实际需求：对查获材料和药物检查提交物的快速筛查、选择性确证，以及针对生物样本的验证程序。
分析工作流程用于尼塔烯的鉴定与定量
非生物样本的分析工作流程
固体样本、假冒制剂、药物检查样本、非法材料查获物中尼塔烯的筛查与鉴定
该领域的分析方法趋于采用两层逻辑：快速的、低样品前处理的推定指示，随后是正交的、实验室级别的确证。推定层旨在便携、非仪器化或最小化仪器使用，并能处理异质固体。振动指纹图谱（如拉曼散射RS、表面增强拉曼SERS、傅里叶变换红外光谱FT-IR）和常压电离技术（如实时直接分析DART）因其无需繁琐样品前处理即可指示苯并咪唑类阿片类药物存在的能力而受到重视，在成分未知或复杂时具有分诊价值。
确证层确保选择性和法律上的可靠性。色谱分离 coupled to MS（三重四极杆和/或高分辨率）用于区分密切相关的类似物，并通过保留时间一致性和产物离子模式验证身份。在参考物质存在的情况下，会利用谱库和离子对列表；在覆盖不完整时，则采用碎片解析策略和高分辨质谱精确质量标准来减轻异构或同量异位干扰的风险。
操作上，作者报告的工作流程兼容快速周转：筛查结果指导是否需要进行完整的确认序列，最少的处理减少了暴露和污染风险。与其他物质的共存以及赋形剂/掺假物的存在是影响推定信号选择和确证分离设计的重要考虑因素。
例如，通过核磁共振（NMR）、高效液相色谱-高分辨质谱（HPLC-HRMS）和毛细管区带电泳（CZE）的组合，在药物检查提交的固体样品中鉴定出高纯度的N-去乙基依托尼塔泽，该样品被冒充为异托尼塔泽出售。振动光谱技术（RS、SERS、FT-IR）已用于在现场使用手持式/便携式仪器鉴定可疑假冒片剂中的不同尼塔烯。然而，即使结合DART-热解吸-MS（TD-MS），也无法实现完整的结构解析，通常需要液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行鉴定，液相色谱-紫外检测（LC-UV）进行定量。
另一种方法是通过实验室合成类似物，然后分析其分离和定量。例如，合成了14种不同的尼塔烯，并通过HPLC-DAD实现了大多数同时分离分析。LC与四极杆-飞行时间质谱（QTOF）联用鉴定了一个所有14种合成化合物共有的碎片离子（m/z 100.11，1,1-二乙基氮杂环丙烷），这可能是未知样品中尼塔烯筛查的诊断性标志物候选。另一项研究合成了四种尼塔烯（美托尼塔泽、依托尼塔泽、普罗尼塔泽、异托尼塔泽）及其四种硝基位置异构体（异尼塔烯），虽然GC-EI-MS未能明确区分尼塔烯和相应的异尼塔烯，但HPLC-MS/MS在异尼塔烯的产物离子谱中观察到了特征碎片离子（m/z 86, 215），从而能够将它们与尼塔烯区分开来。
环境与社区分析（废水等）
环境/社区研究将废水流行病学定位为个案工作的补充工具。采样策略（复合或特定时间）与富集步骤相结合，以实现对目标分析物和相关代谢物的低检测限。LC-MS（/HRMS）方法是标准做法，可疑物列表会更新以反映类似物可获得性的变化。目标不是个体归因，而是群体水平的信号，以为早期预警和优先排序提供信息。
分析叙述强调废水典型的基质效应和干扰，需要稳健的净化和选择性检测。在使用HRMS的情况下，非靶向或可疑筛查能够随着新类似物的出现进行回顾性挖掘。结果解读通常附带注意事项，例如在污水输送过程中可能发生的转化错误、间歇性负荷和标准化选择，重点在于趋势指示而非定量流行率。这些输出可以反馈到人体基质检测面板中，支持关于哪些尼塔烯应纳入常规筛查的决策。
例如，在2022年至2024年间，使用经过验证的HPLC-MS/MS（三重四极杆，TQ）方法在22个国家的废水中监测了八种尼塔烯。阳性样本仅在美国和澳大利亚发现，检测到的唯一尼塔烯是普罗尼塔泽和依托尼塔吡。然而，由于预期的分析物浓度极低以及基质复杂性，废水中尼塔烯的分析仍然特别具有挑战性，需要有效的净化策略并仔细考虑样品储存和运输条件，这些条件可能会显著影响分析物的稳定性和分析响应。
合成材料
这些研究主要关注于建立通用规则或工作流程的可能性，这有助于实验室首先确认尼塔烯的普遍存在，然后是特定类似物的存在。重点也在于先进技术的适用性，这些技术可以简化鉴定工作，特别是区分异构体的任务。
大多数定量方法使用HPLC或UHPLC与TQ联用以获得最大灵敏度。然而，在某些情况下也可以应用其他分离技术，例如气相色谱（GC）。通过直接ESI-HRMS（QTOF）灌注研究了38种不同尼塔烯的裂解行为，为大多数R1、R2、R3和R4取代基找到了诊断性碎片，并提出了用于鉴定未知类似物的标准化工作流程。
研究证实，与芬太尼类类似，几种尼塔烯由于质子化异构体的存在而表现出两个离子淌度谱（IMS）碰撞截面（CCS）分布，并且在ESI源中加入水会显著改变这些分布。结合轨道阱MS裂解研究和结构无损离子操控（SLIM）IMS（+溶剂）实验，提出了所研究尼塔烯在气相中可产生三种质子化异构体的假设。最后，使用ESI-IMS-HRMS部分解析了四组结构相似的尼塔烯异构体，表明基于MS的工作流程中的高分辨率IMS分离可能适用于新兴尼塔烯的无参考鉴定。
生物样本的分析工作流程
体外和动物研究
利用体外系统和体内动物模型进行的机制研究可为跨基质的尼塔烯鉴定提供基础。通过表征生物转化途径和裂解行为，这些研究旨在识别诊断性离子和中性丢失，这些信息后续可支持在人体和环境工作流程中的可疑筛查和确证。它们还有助于理解类似物间的差异，并预测在某些基质中可能更丰富或更稳定的代谢物。
从实践角度看，这些机制数据被重新用于填充离子对列表、优化色谱程序以分离异构体，并为基质效应或电离效率提供初步数据。由于参考标准的可用性可能落后于市场出现，这些努力对于在标准和谱库跟上之前降低假阴性风险非常有价值。
例如，一项体外研究测试了依托尼塔哌嗪在人肝微粒体中的代谢，通过HPLC-HRMS（轨道阱）鉴定了总共23种代谢物（其中13种在尿液中）。另一项研究在大鼠血浆中测定了异托尼塔泽的主要药代动力学和药效学特征，并通过LC-MS/MS定量了N-去乙基、4'-羟基和5-氨基代谢物。现有代谢研究表明，尼塔烯经历快速的I相生物转化，最常见的是通过N-脱烷基化和芳香族羟基化，硝基还原也有报道。在已发表的体外和体内研究中，原型化合物通常是血浆中的主要物种，而相应的N-去乙基和羟基化代谢物浓度较低。药代动力学/药效学（PK/PD）数据表明系统清除快，原型药物暴露与μ阿片介导的效应之间存在密切的时间关联。
人体生物体液中尼塔烯的鉴定
人体生物基质中尼塔烯鉴定的分析方法通常依赖于靶向多反应监测（MRM）面板或基于HRMS的筛查，应用于血液、血浆/血清、尿液、头发和口腔液。样品制备通常根据基质复杂性和预期浓度范围进行定制，平衡通量与净化度。确认程序利用保留时间一致性和诊断性产物离子比率，并通过色谱分离或碎片特异性标准来解决异构体干扰问题。
尸检场景引入了分布和稳定性等解释上的细微差别，而临床/法医背景则优先考虑周转时间和明确的判定。报告标准通常强调多个标识符的一致性、适当的对照，以及在MS之前进行免疫分析筛查时处理潜在交叉反应性。尽管口腔液在药物测试中的应用日益增多，但迄今为止尚未报道专门为该基质中尼塔烯类物质开发和验证的生物分析方法。只有零散的多分析物滥用药物方法可用，其中偶尔将尼塔烯类似物纳入目标物。
在许多情况下，尼塔烯可以在中毒或药物滥用案件的法医检查期间在生物体液中鉴定出来。非靶向HRMS是目前用于此目的的最有力工具之一。采用源自代谢组学的方法，生成分子网络（可能使用来自不同生物体液的数据），从而可以鉴定原型药物和一种或多种代谢物。该工作流程应用于两例严重中毒病例，使用轨道阱质谱，结果是在血浆和尿液中均鉴定出第一例为普罗尼塔泽，第二例为普罗尼塔吡，以及前者的几种I相（羟基化、N-去乙基化、O-去丙基化）和II相（葡萄糖醛酸苷）代谢物，后者仅鉴定出一种代谢物（普罗尼塔吡酸）。
根据与硝基苯二氮卓类药物的类比，推测细菌降解可能导致硝基-尼塔烯形成氨基和乙酰氨基衍生物。在一例真实的美托尼塔泽中毒案件的未防腐尸检血液中进行了这些代谢物的推定鉴定。UHPLC-HRMS（QTOF）使作者能够检测到与5-氨基美托尼塔泽和5-乙酰氨基美托尼塔泽形成相容的碎片。早期添加稳定剂（草酸盐、氟化物）可防止检测到这些碎片。
人体生物体液中尼塔烯的定量
定量方法主要是LC-MS/MS（TQ），偶尔基于HRMS，并通过验证要素构建：校准模型和范围与临床/法医学相关水平一致；灵敏度表示为检测限（LOD）/定量下限（LLOQ）；各质控（QC）水平的精密度和准确度；选择性和残留控制；以及基质效应评估。色谱程序经过调整以在必要时分离密切相关的类似物，或者在共洗脱不可避免时选择离子对以保持特异性。
稳定性研究（室温、冻融、处理后自动进样器）和稳健性考虑反复出现，反映了支持常规应用的意图。作者还经常强调内标（IS）策略和验收标准的重要性，这些标准应与预期用途（监测、临床支持或尸检解释）相称，而不超出数据支持的范围。
血液和其他血源性基质、尿液
样品管理和分析挑战在全血、血源性基质（血浆/血清）和尿液之间有所不同。全血通常要求更高，因为其含有细胞成分和较高的基质效应；而血浆/血清通常背景更干净，但仍需注意蛋白质相关干扰；尿液则受可变稀释度和频繁存在的结合代谢物影响，常常需要进行水解和仔细的校准策略。
LC-MS/MS应用于碱性乙酸乙酯液液萃取（LLE）后的全血中21种尼塔烯和5种代谢物的测定，达到了出色的灵敏度（26种分析物中的25种可达10 pg/mL），这也得益于样品处理过程中实现的10倍浓缩比。相同的样品制备技术（LLE）也用于使用碱性乙酸乙酯和N-丁基氯混合物萃取九种尼塔烯类似物和/或代谢物，并进行HPLC-MS/MS（TQ）分析。
九种尼塔烯在应用96孔板形式的支撑膜-液相微萃取（SM-LPME）后在全血中进行测定，尽管单次萃取需要45分钟，但仍可实现高通量。与电膜萃取（EME）程序的比较突显了前一种技术的更好性能。
在法医分析中，通常对尿液、血液及衍生基质（血浆、血清）采用统一的样品制备程序。例如，使用冰冷的乙腈（ACN）进行蛋白质沉淀，结合尿液酶水解，用于通过HPLC-MS/MS（Qtrap）定量依托尼塔哌嗪。相同的色谱设置和样品制备程序后来用于定量血液衍生基质和尿液中的N-吡咯烷基普罗尼塔泽。反过来，相同的样品制备和分析方法是从先前发表的关于定量非尼塔泽合成阿片类药物溴芬太尼和AP-238（一种肉桂基哌嗪）的论文改编而来。
微型样本
鉴于已发表的关于生物体液中尼塔烯分析的论文数量有限，其中只有少数包含微采样应用也就不足为奇了。然而，这种方法具有重要优势，例如侵入性更小、稳定性更好、费用更低、运输和储存更便捷、更易于自动化。
其中，一项研究将体积计量干血点（vDBS）应用于9种尼塔烯和溴芬太尼的分析。vDBS通过Capitainer B卡进行，该卡允许从指尖采血准确采集一个10μL的DBS（单张卡可通过沉积两滴血获得最多两个DBS）。样品制备通过溶剂（甲醇/乙腈，3/1，V/V）超声辅助萃取（UAE）进行，然后干燥、重新溶解（30μL甲醇）并进样至UHPLC-MS/MS。由于内标（芬太尼-D5）是与萃取溶剂一起添加的，因此它未与分析物一起被萃取，这限制了其效用。
另一项研究通过原创的HPLC-HRMS方法测试了几种尼塔烯在室温或4°C储存的DBS中的稳定性，发现低浓度分析物比高浓度分析物更不稳定，并且温度对不同分析物浓度有不同的影响。
头发分析
自首次报道后，通过UHPLC-MS/MS（TQ）从头发分析中获得了关于尼塔烯使用的回顾性信息。第二种方法允许在皮克/毫克浓度范围内监测17种不同的尼塔烯（分为6个异构体组），色谱运行时间仅需6分钟。还进行了另一项回顾性评估。
对尼塔烯的分析研究反映了应对新型合成阿片类药物的更广泛演变，实验室工作流程不断适应新的类似物和不断变化的市场趋势。尽管文献中描述了多种技术，但一个共同要求显现出来：基于严格验证的分析灵活性，其中快速筛查和确认分析以保持科学可靠性的方式整合在一起。
尼塔烯说明了与高效且结构多样的合成阿片类药物相关的许多困难，包括参考标准品的可用性有限、异构复杂性以及新衍生物的不可预测出现。作为回应，实验室结合了高分辨质谱、靶向定量以及关于代谢和裂解的机制信息。这种综合方法加强了化合物鉴定，并支持在法医、临床和监测环境中进行更一致的结果比较。
另一个反复出现的主题是方法的互操作性。色谱条件的趋同、反复出现的诊断性碎片和共享谱库指出了分析实践更大程度协调统一的趋势。这种趋同对于确保不同实验室产生的结果保持可比性和稳健性至关重要，特别是在可能用于监管或法律背景的情况下。
总体而言，为尼塔烯开发的框架可视为应对未来一代设计药物的模型：动态且数据驱动，但同时锚定于清晰的验证标准和标准化报告。在创新与协调之间保持这种平衡对于确保应用于毒理学、法医学和医疗保健场景的先进分析方法继续支持近期和长期的公共健康目标至关重要。
