柠檬源细胞外纳米囊泡作为氯马斯汀递送载体的评估：基于少突胶质细胞模型内钙离子动力学的机制探究

《Journal of Drug Delivery Science and Technology》：Evaluation of Lemon-derived Extracellular Nanovesicles as a nanocarrier for Clemastine: insights from intracellular calcium dynamics in an oligodendrocyte cell model

本研究针对多发性硬化等脱髓鞘疾病中髓鞘再生修复的临床需求，开发了一种从有机柠檬中提取细胞外纳米囊泡（LENVs）的绿色、简便方法。研究人员成功将促髓鞘再生药物氯马斯汀（CLM）高效载入LENVs，构建了CLM-LENVs递送系统。体外实验证实，该递送系统能更显著、更持久地降低少突胶质前体细胞（MO3.13）内的钙离子（Ca2+）水平，表明其通过靶向M3R/Ca2+信号轴，有效促进了少突胶质细胞分化，为开发基于植物源纳米囊泡的神经再生疗法提供了新策略。

在神经科学领域，多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）等脱髓鞘疾病是导致患者残疾的主要原因之一。这类疾病的核心病理特征是神经纤维外层的保护性髓鞘被破坏，导致神经信号传导受阻。尽管现有疗法能控制炎症，但尚无有效手段能逆转髓鞘损伤、促进髓鞘再生。因此，开发能够促进髓鞘修复的再生疗法，已成为当前神经科学研究的焦点。

氯马斯汀（Clemastine, CLM）作为一种组胺H1受体拮抗剂，近年来被发现具有促进髓鞘再生的“老药新用”潜力。其作用机制并非通过抗组胺，而是通过其“脱靶效应”拮抗M3毒蕈碱受体（M3R）。在少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte Precursor Cells, OPCs）中，M3R信号通路是细胞分化的“刹车”。当M3R被激活时，会引发细胞内钙离子（Ca²⁺）的剧烈释放，从而抑制OPCs分化为成熟的、能够产生髓鞘的少突胶质细胞。因此，通过CLM阻断M3R，降低细胞内Ca²⁺水平，被认为是促进髓鞘再生的关键机制。

然而，如何将CLM高效、安全地递送至中枢神经系统的病变部位，并精准作用于OPCs，是将其转化为有效疗法的核心挑战。传统的药物递送系统往往面临生物相容性差、免疫原性高或制备工艺复杂等问题。

在此背景下，植物源细胞外纳米囊泡（Plant-derived Extracellular Nanovesicles, ENVs）作为一种新兴的天然药物递送平台，展现出巨大潜力。与动物源囊泡相比，植物源囊泡具有生物安全性高、免疫原性低、来源广泛、易于规模化生产等优势。特别是，利用农业废弃物（如柠檬果肉）提取囊泡，不仅成本低廉，还符合可持续发展的理念。

本研究旨在开发一种从有机柠檬中提取细胞外纳米囊泡（Lemon-derived Extracellular Nanovesicles, LENVs）的绿色、简便方法，并将其作为CLM的递送载体，构建CLM-LENVs复合物。研究团队的核心假设是：LENVs能够作为高效的纳米载体，将CLM递送至OPCs，通过更有效地拮抗M3R，从而更显著地降低细胞内Ca²⁺水平，最终促进OPCs的分化。为了验证这一假设，研究人员在MO3.13细胞（一种人少突胶质细胞模型）中，利用钙离子成像技术，直观地观察并比较了CLM-LENVs、游离CLM以及空白LENVs对细胞内Ca²⁺信号的影响。

该研究论文发表于《Journal of Drug Delivery Science and Technology》。

关键技术方法

本研究采用了一种创新的“自分离两相法”从有机柠檬果肉中提取LENVs，该方法无需超速离心或有机溶剂，仅通过匀浆、过滤、低温静置自分离凝胶相、离心和系列过滤等步骤即可获得。通过循环水化-冻干法将CLM载入LENVs。利用动态光散射（DLS）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电镜（TEM）对LENVs和CLM-LENVs的粒径、电位、形态和稳定性进行表征。通过间接法（分离游离药物）测定载药效率。在MO3.13细胞模型中，通过转染GCaMP5钙离子指示剂，利用荧光显微镜进行钙成像，实时监测并量化不同处理组对细胞内Ca²⁺水平的调节作用。

研究结果

3.1. LENVs的提取与表征

研究人员建立了一种无需超速离心和有机溶剂的绿色提取方法。该方法的关键步骤是让柠檬汁在4°C下静置，使其自发分离出凝胶相。去除凝胶相后，再通过离心和系列过滤，最终获得LENVs。NTA分析显示，该方法获得的LENVs粒径均一，浓度高达7.62E+10±3.57E+09 particles/mL，优于传统超速离心法。TEM观察证实LENVs呈球形囊泡结构。稳定性实验表明，LENVs在-18°C下储存28天，粒径变化极小，表现出良好的物理稳定性。

3.2. CLM-LENVs的制备与表征

通过循环水化-冻干法，成功将CLM载入LENVs。载药效率高达80.7 ± 9.9%。TEM观察显示，载药后囊泡形态保持完整。DLS和NTA分析表明，载药后囊泡粒径略有增加，但分布仍较为均一。体外释放实验证实，CLM-LENVs在14天内具有良好的药物保留能力和物理稳定性。

3.3. 钙成像分析

在MO3.13细胞模型中，通过钙成像技术评估了不同处理对细胞内Ca²⁺水平的影响。结果显示，CLM-LENVs处理组在增殖和分化两种培养条件下，均表现出最显著且最持久的细胞内Ca²⁺水平下降。相比之下，游离CLM处理组虽然也能降低Ca²⁺水平，但其效果弱于CLM-LENVs。而空白LENVs处理组则对Ca²⁺水平无明显影响，甚至略有升高。这表明LENVs作为载体，显著增强了CLM对细胞内Ca²⁺信号的调节能力。

结论与讨论

本研究成功开发了一种从柠檬中提取细胞外纳米囊泡（LENVs）的绿色、简便且可扩展的方法。该方法不依赖昂贵的超速离心设备或有害溶剂，为植物源纳米囊泡的广泛应用奠定了基础。研究证实，LENVs能够高效装载促髓鞘再生药物氯马斯汀（CLM），形成稳定的CLM-LENVs复合物。

最关键的是，体外功能实验证明，CLM-LENVs在调节少突胶质细胞（MO3.13）内钙离子（Ca²⁺）信号方面，表现出比游离CLM更优越的性能。这种更显著、更持久的Ca²⁺水平下降，为CLM通过拮抗M3毒蕈碱受体（M3R）促进少突胶质前体细胞（OPCs）分化的机制提供了直接证据。

综上所述，本研究不仅提供了一种可持续的植物源纳米囊泡提取技术，更重要的是，证明了LENVs作为药物递送平台，能够有效增强CLM的生物活性。这为开发针对多发性硬化（MS）等脱髓鞘疾病的再生疗法，提供了一种有前景的新策略。