Fbxo2通过泛素化降解YTHDF2抑制前列腺癌进展的机制研究

《Cell Death & Disease》：Fbxo2 suppresses prostate cancer progression by regulating YTHDF2 ubiquitination and degradation

本研究针对前列腺癌(PCa)中E3泛素连接酶调控机制不清的问题，探讨了Fbxo2在PCa进展中的作用。研究人员发现Fbxo2在PCa组织中低表达且与良好预后相关，并通过实验证实Fbxo2作为E3连接酶介导致癌蛋白YTHDF2的泛素化降解，进而稳定CDKN1C mRNA，抑制PCa增殖和转移。该研究揭示了Fbxo2-YTHDF2-CDKN1C轴在PCa中的抑癌机制，为PCa治疗提供了新的潜在靶点。

　　

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内是男性癌症相关死亡的第二大原因。据统计，2024年美国预计将有约299,010例新发前列腺癌病例和65,790例相关死亡，占所有男性癌症诊断的29%以上。尽管过去十年在前列腺癌的临床治疗方面取得了显著突破，包括手术切除、化疗、免疫治疗和靶向治疗，但高危前列腺癌和去势抵抗性前列腺癌(CRPC)患者的预后仍然较差。一旦发生转移，前列腺癌的五年生存率会急剧下降至30%左右。因此，迫切需要进一步阐明前列腺癌进展的分子和细胞机制。

泛素化是一种由三种酶(E1激活酶、E2结合酶和E3连接酶)级联介导的翻译后修饰。近年研究表明，泛素化在调控转录、细胞周期进程和各种信号通路等多种生物学过程中起着关键作用。E3泛素连接酶中最大的家族是Ring-finger蛋白家族，其中SCF(Skp1-Cullin-F-box)型泛素连接酶是研究最为深入的一类。F-box蛋白作为SCF复合物的底物识别组分，通过调控DNA损伤反应、细胞周期控制、上皮-间质转化(EMT)以及AKT/PI3K、p53、BMP、NRF2、NF-κB和Hippo等多种信号通路，影响肿瘤增殖、转移和侵袭过程。

本研究聚焦于Fbxo2（也称为FBG1或Fbs1），它是FBXO蛋白亚家族的成员，特异性识别天冬酰胺连接的高甘露糖型碳水化合物链。虽然早期证据表明Fbxo2抑制肿瘤细胞增殖，但更多近期研究报道了它在几种癌症中通过介导关键肿瘤抑制因子（如p53、SUN2和FBN1）的泛素化而发挥致癌作用。然而，Fbxo2在前列腺癌中的功能仍不清楚，值得进一步研究。

为了探究Fbxo2在前列腺癌中的作用，研究人员开展了一系列实验和生物信息学分析。该研究发表于《Cell Death & Disease》杂志，揭示了一条新的Fbxo2/YTHDF2/CDKN1C调控轴在前列腺癌进展中的关键作用。

研究人员主要应用了以下关键技术方法：利用GEPIA和UALCAN数据库进行生物信息学分析；通过免疫组织化学(IHC)和蛋白质印迹(Western blot)检测临床组织样本中蛋白表达；构建稳定过表达和敲低Fbxo2的前列腺癌细胞系进行功能获得和功能缺失实验；采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、集落形成、Transwell小室侵袭、伤口愈合和流式细胞术等体外功能实验；建立裸鼠皮下异种移植瘤模型和肺转移模型进行体内功能验证；通过免疫共沉淀-质谱联用(co-IP-MS)、免疫共沉淀(co-IP)和免疫荧光(IF)鉴定蛋白质相互作用；使用环己酰亚胺(CHX)追踪实验和蛋白酶体抑制剂MG132处理评估蛋白质稳定性；进行体外泛素化实验确定泛素化修饰；通过RNA斑点印迹、m⁶A甲基化RNA免疫共沉淀测序(MeRIP-seq)、RNA免疫共沉淀(RIP)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)等分析m⁶A修饰和mRNA稳定性。

Fbxo2在PCa组织中下调并与良好预后相关

研究人员首先通过生物信息学数据库分析发现，Fbxo2在PCa组织中的表达低于正常前列腺组织，且较高的Fbxo2表达与PCa患者较好的预后相关。免疫组织化学和蛋白质印迹分析临床标本进一步证实，Fbxo2在肿瘤组织中的蛋白水平显著低于配对癌旁正常组织。在前列腺癌细胞系中，Fbxo2表达也明显降低。

Fbxo2抑制细胞增殖和运动并诱导凋亡

为了研究Fbxo2在PCa中的生物学功能，研究人员建立了稳定过表达Fbxo2的PC3和DU145细胞系。功能实验表明，Fbxo2过表达显著抑制了PCa细胞的增殖、侵袭和迁移能力，并诱导了更高水平的细胞凋亡。体内皮下异种移植瘤模型实验结果显示，Fbxo2过表达细胞形成的肿瘤体积明显小于对照组。此外，在前列腺癌患者来源类器官(PDO)模型中，Fbxo2过表达也显著抑制了肿瘤生长。

Fbxo2敲低促进增殖、运动并抑制凋亡

为了进一步验证Fbxo2的功能，研究人员构建了Fbxo2敲低模型。实验结果显示，敲低Fbxo2增强了PCa细胞的增殖能力、侵袭和迁移能力，并显著减少了细胞凋亡。这些发现共同表明Fbxo2通过抑制细胞生长和运动在PCa中发挥肿瘤抑制因子作用。

Fbxo2靶向YTHDF2进行泛素化和蛋白酶体降解

为了识别Fbxo2的潜在底物，研究人员进行了免疫共沉淀-质谱联用分析，发现YTHDF2是Fbxo2的结合伴侣。后续实验证实了Fbxo2和YTHDF2之间存在内源性和外源性相互作用，且两者主要共定位于PCa细胞的细胞质中。过表达Fbxo2显著降低了YTHDF2蛋白水平，但不影响其mRNA水平；而敲低Fbxo2则增加了YTHDF2蛋白表达。这些结果表明Fbxo2通过转录后机制影响YTHDF2蛋白水平。

Fbxo2介导YTHDF2泛素化的机制

研究人员通过环己酰亚胺追踪实验发现，Fbxo2敲低延长了YTHDF2蛋白的半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132处理能够逆转Fbxo2过表达引起的YTHDF2蛋白水平降低。泛素化实验表明Fbxo2过表达增加了YTHDF2的泛素化。通过结构域映射实验，研究人员发现Fbxo2的羧基末端(C末端)区域是与YTHDF2结合并介导其泛素化和降解所必需的，而YTHDF2的氨基末端(N末端)结构域负责与Fbxo2结合。通过点突变实验，研究人员进一步确定YTHDF2的赖氨酸286(K286)是Fbxo2介导泛素化的关键位点。

YTHDF2敲低部分消除Fbxo2敲低引起的增殖和运动增强

研究人员发现YTHDF2在PCa组织和细胞系中表达上调，且敲低YTHDF2抑制了PCa细胞的增殖和侵袭。为了验证YTHDF2是否参与Fbxo2介导的肿瘤抑制，研究人员进行了挽救实验。功能实验表明，Fbxo2敲低引起的致癌效应被YTHDF2敲低所逆转。体内实验也显示，同时敲低Fbxo2和YTHDF2减少了单独敲低Fbxo2所引起的肿瘤体积和重量增加。此外，YTHDF2抑制剂DC-Y13-27能够抑制PCa细胞增殖，并在Fbxo2敲低细胞中逆转由Fbxo2缺失引起的促增殖效应。

YTHDF2以m⁶A依赖性方式调控CDKN1C mRNA降解

研究人员通过RNA m⁶A斑点印迹实验发现，Fbxo2表达与PCa细胞中的m⁶A甲基化水平呈正相关。通过整合分析MeRIP-seq、mRNA-seq、RIP-seq数据以及Fbxo2/YTHDF2相关基因列表，研究人员筛选出14个重叠候选基因，其中CDKN1C因其在PCa中作为肿瘤抑制因子的功能而备受关注。实验证实YTHDF2敲低或Fbxo2过表达导致CDKN1C mRNA表达显著增加，且YTHDF2缺失延长了CDKN1C mRNA的半衰期。RNA免疫共沉淀实验表明YTHDF2能够富集CDKN1C mRNA，而MeRIP-RT-qPCR实验验证了CDKN1C 3'UTR上存在两个特异的m⁶A修饰位点。这些结果表明YTHDF2通过识别CDKN1C mRNA 3'UTR上的特异性m⁶A修饰位点，调控其mRNA降解。

研究还证实，在皮下异种移植瘤和前列腺癌组织中，CDKN1C表达与Fbxo2表达呈正相关，与YTHDF2表达呈负相关。体内肺转移模型实验显示，Fbxo2过表达显著减少了肺转移结节数量，且转移结节中CDKN1C表达上调，YTHDF2表达下调。人类PCa组织芯片的免疫组织化学染色显示，YTHDF2表达与Fbxo2表达呈负相关，CDKN1C表达与Fbxo2表达呈正相关。此外，高Fbxo2表达与PCa患者较好的预后显著相关。

本研究揭示了一个先前未被充分认识的调控轴——Fbxo2/YTHDF2/CDKN1C——在PCa进展中起着关键作用。Fbxo2作为肿瘤抑制因子，通过靶向致癌m⁶A阅读器YTHDF2进行泛素化和蛋白酶体降解，从而稳定m⁶A修饰的肿瘤抑制mRNA如CDKN1C。这种稳定作用抑制了PCa细胞的生存和增殖。该研究不仅为理解PCa的分子机制提供了新的见解，而且突出了靶向Fbxo2-YTHDF2-CDKN1C轴用于未来抗癌策略的治疗潜力。

研究的讨论部分强调，Fbxo2在不同癌症类型中可能发挥双重作用，这取决于癌症类型和细胞背景。在本研究中，Fbxo2被确定为PCa中的肿瘤抑制因子。作为E3泛素连接酶，Fbxo2促进底物泛素化和蛋白酶体依赖性降解。虽然之前已经指出了一些Fbxo2的底物，但本研究通过co-IP-MS分析将YTHDF2鉴定为Fbxo2的新底物。YTHDF2的失调与多种疾病相关，包括癌症，并且根据癌症类型可能发挥肿瘤抑制因子或致癌因子的作用。

不同癌症类型似乎具有不同的YTHDF2下游效应物。在本研究中，CDKN1C被确定为PCa细胞中YTHDF2的关键效应物。CDKN1C基因编码p57^Kip2蛋白，属于细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的CIP/Kip家族。CDKN1C的肿瘤抑制潜力通过其与散发性癌症和Beckwith-Wiedemann综合征的关联得以凸显。CDKN1C的下调通常在多种恶性肿瘤中观察到，包括乳腺癌、白血病、肾上腺皮质癌、尿路上皮癌和PCa。因此，YTHDF2介导的CDKN1C降解有助于肿瘤进展，并支持恢复CDKN1C表达可能作为前列腺癌治疗策略的假设。

总之，这些发现揭示了Fbxo2-YTHDF2-CDKN1C轴在前列腺癌中的重要作用，为开发新的治疗策略提供了理论基础。该研究深化了对E3泛素连接酶和m⁶A RNA甲基化阅读器在癌症中相互作用的理解，为前列腺癌的预后评估和靶向治疗提供了新的潜在生物标志物和治疗靶点。