《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：Top-Down Proteomics Study of Aging and Sexual Dimorphism of Zebrafish Brains
编辑推荐：
本综述系统介绍了利用基于毛细管区带电泳-串联质谱（CZE-MS/MS）的顶向下蛋白质组学（TDP）技术，首次在斑马鱼模型中开展脑衰老与性别二态性研究。研究通过分析6、16、24月龄斑马鱼脑组织的蛋白质形态（proteoform），揭示了与神经丝组装、多巴胺能神经元分化和突触小泡启动等关键生物学过程相关的蛋白质形态存在显著的年龄和性别特异性差异。特别发现24月龄雌性斑马鱼脑中存在AP2B1截短蛋白质形态，为理解脑衰老分子机制提供了新视角。该研究凸显了TDP技术在解析脑衰老复杂分子网络中的独特价值。
研究背景与意义
衰老是伴随生理功能进行性衰退的复杂生物学过程，其中脑衰老主要表现为认知能力缓慢下降，并与阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病密切相关。值得注意的是，痴呆症发病存在显著性别二态性。为深入解析脑衰老分子机制，需要在蛋白质形态水平系统表征脑内生物分子随年龄和性别的动态变化。传统自上而下蛋白质组学（BUP）虽能高效鉴定蛋白质，但无法保留由RNA选择性剪接和翻译后修饰（PTM）产生的完整蛋白质形态信息。而基于质谱（MS）的顶向下蛋白质组学（TDP）通过直接分离检测完整蛋白质形态，为研究蛋白质形态功能提供了理想工具。
实验设计与方法
本研究以斑马鱼为模型，利用其寿命短（约3年）、脑结构与人类相似等优势，采用CZE-MS/MS技术对6月龄（年轻）、16月龄（中年）和24月龄（老年）雌雄斑马鱼脑组织进行定量TDP分析。样品经尿素裂解、离心除杂后，通过30 kDa分子量截留超滤离心管进行缓冲液置换，最终采用动态pH junction-CZE-MS/MS方法进行分析。数据通过TopFD/TopPIC流程进行蛋白质形态鉴定，并以TopDiff软件进行标记定量分析。
年龄相关蛋白质形态动态变化
研究共鉴定雌性斑马鱼脑1106个蛋白质形态（对应396种蛋白质），雄性1707个蛋白质形态（对应490种蛋白质）。维恩图显示24月龄组特有蛋白质形态数量显著增多（雌性529个，雄性922个），提示该时期是脑衰老关键节点。定量分析发现，雌性脑中59、142、69个蛋白质形态在6-16月、6-24月、16-24月比较中表达差异显著；雄性则分别为81、226、193个。这些差异表达的蛋白质形态涉及神经丝束组装、多巴胺能神经元分化等生物学过程。
典型案例分析发现，神经丝轻链多肽（NEFL）中存在C末端特异性蛋白质形态，其+79.034 Da质量偏移可能源于磷酸化修饰；β-突触核蛋白和γ1a-突触核蛋白分别呈现乙酰化修饰和+71.94 Da质量偏移的蛋白质形态，二者在年轻雄性脑中高表达。在老年雄性脑中，苹果酸脱氢酶（MDH2）的两个截短蛋白质形态表达上调6.5倍和2.2倍，提示三羧酸循环代谢重编程；钠钾转运ATP酶α亚基（α3Na+/K+-ATPase）的14种蛋白质形态表达升高，可能与神经元兴奋性调控相关。
磷酸化修饰方面，研究发现Hmgn6、Calm1a、Dpysl3和Nfma等蛋白质的磷酸化蛋白质形态在衰老过程中发生显著改变。其中Dpysl3作为细胞骨架调控蛋白，其磷酸化状态变化可能直接影响神经元功能衰退。
性别二态性蛋白质组特征
比较同龄雌雄脑蛋白质组发现，6月龄组38个蛋白质形态（27种蛋白质）、16月龄组54个蛋白质形态（40种蛋白质）、24月龄组207个蛋白质形态（123种蛋白质）表达存在显著性别差异。功能分析显示：
- •
6月龄组：氧转运过程相关蛋白（如α-珠蛋白样蛋白和血红蛋白β2亚基）在雌性脑高表达
- •
16月龄组：轴突生成相关蛋白（微管相关蛋白1A和HMGN-17）呈现雌性高表达特征
- •
24月龄组：磷酸肌酸生物合成过程最为显著，肌酸激酶（CK）的5种截短蛋白质形态呈现性别特异性表达模式，其中4种在雄性高表达，1种在雌性表达升高5倍。同时，胸腺素β（Tβ）的两个完整蛋白质形态在雌性脑显著高表达，可能通过调控肌动蛋白单体参与神经元分化。
突破性发现
研究首次在24月龄雌性斑马鱼脑中鉴定出AP2B1截短蛋白质形态（质量偏移250.125 Da）。AP2衔接体复合物近期被证实与网格蛋白介导的内吞作用和细胞衰老密切相关，该发现为揭示年龄和性别特异性脑衰老机制提供了新线索。
结论与展望
本研究通过CZE-MS/MS技术实现了斑马鱼脑蛋白质形态的高分辨率定量分析，系统揭示了脑衰老过程中蛋白质形态的动态变化规律和性别二态性特征。发现的年龄和性别特异性蛋白质形态变化，为理解神经退行性疾病机制和开发精准诊疗策略提供了重要分子基础。该研究也证明了TDP技术在复杂生物体系蛋白质形态解析中的强大应用潜力。
