《Molecular Oncology》：Plecstatin inhibits hepatocellular carcinoma tumorigenesis and invasion through cytolinker plectin
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本文系统阐明了金属基抗癌药物Plecstatin（PST）通过特异性靶向细胞骨架连接蛋白plectin，而非外致密纤维蛋白2（ODF2），有效抑制肝细胞癌（HCC）的锚定非依赖性生长、二维/三维迁移和侵袭的作用机制。研究结合CRISPR/Cas9基因敲除、蛋白质组学分析和临床数据集关联分析，证实plectin是PST发挥抗肿瘤活性的主要效应器，并揭示了plectin/ODF2轴在调控整合应激反应（ISR）和细胞凋亡中的协同作用，为开发靶向细胞骨架的肝癌治疗策略提供了重要理论依据。
摘要
Plecstatin（PST）是一种在临床前模型中显示出强效抗癌活性的钌基前药，但其精确的作用机制及其主要靶点plectin和outer dense fiber protein 2（ODF2）的分子特异性尚未完全阐明。本研究利用CRISPR/Cas9技术在SNU-475肝细胞癌（HCC）细胞中敲除plectin（PLEC）和ODF2基因，以剖析PST的作用模式。研究发现，PST以剂量依赖的方式抑制野生型（WT）和ODF2缺陷细胞的锚定非依赖性生长，并削弱其二维和三维迁移能力，但在PLEC缺陷细胞中无此效应，从而确定plectin是PST抗肿瘤活性的主要效应器。蛋白质组学和功能分析表明，PST主要通过plectin破坏细胞骨架重塑，同时选择性影响与ODF2缺失相关的纤毛发生通路。敲除任一蛋白均会减弱PST诱导的eIF2α Ser51磷酸化、ATF4/GADD34诱导以及细胞色素c释放，表明二者协同参与整合应激反应（ISR）。对患者数据集的关联分析证实了PLEC/ODF2表达与ISR相关基因特征之间的关联，支持了该通路的临床相关性。这些发现共同确定了plectin是PST破坏细胞骨架完整性的关键靶点，并确立了plectin/ODF2轴在PST驱动的HCC应激适应中的作用。
1 引言
肝细胞癌（HCC）是全球发病率不断上升的主要健康负担。目前，针对HCC关键致癌驱动因子（如TERT, TP53, FGF19, MYC, CTNNB1）的有效靶向疗法仍然缺乏。针对晚期患者的系统疗法，包括多激酶抑制剂、抗VEGF药物和免疫检查点抑制剂，常伴有副作用、耐受性有限和疗效一般等问题，凸显了对更有效、耐受性更好治疗方案的迫切需求。
一类新兴的抗癌策略涉及使用金属药物（如铂、金或钌基化合物）靶向细胞骨架丝和细胞骨架相关蛋白。其中，我们先前鉴定了一种新型的S,N-双齿吡啶羧硫代酰胺钌（芳烃）复合物，命名为plecstatin（PST），其通过质谱（MS）靶点分析确定的两个主要靶点是plectin和外致密纤维蛋白2（ODF2）。PST以金属-卤素前药形式给药，在细胞环境中通过水解激活后，优先结合其选择性靶点。我们最近在多种HCC临床前模型中证明了PST的强大抗肿瘤功效，包括抑制皮下Huh7异种移植瘤的生长和TP53缺陷背景下MYC驱动的HCC肿瘤，并能显著减少HCC细胞的肺侵袭。
PST的主要靶点plectin是一种细胞骨架交联蛋白（cytolinker），对于细胞骨架完整性至关重要，介导中间丝与肌动蛋白、微管和细胞粘附复合物的相互连接。通过调节细胞骨架组织，plectin调控癌细胞的迁移、侵袭和异种移植瘤生长，使其成为肿瘤细胞力学背景下有前景的分子靶点。Plectin在多种肿瘤类型（包括HCC）中经常在mRNA和蛋白水平上调，其表达升高与更具侵袭性的疾病和不良预后相关。
在分子水平上，我们先前表明PST破坏了plectin介导的细胞骨架交联和向粘附位点的力传导，从而干扰了促进肿瘤生长和迁移的机械信号通路。除了靶向表面plectin的单克隆抗体外，PST是目前已知唯一能调节plectin功能的化合物，能有效模拟遗传性plectin缺失。
为了阐明PST在肝细胞癌背景下的详细作用模式和特异性以促进其临床转化，我们采用了一种基于蛋白质组学的靶点-反应分析策略。该方法使我们在接近生理条件下评估靶点选择性，plectin成为PST的最高结合靶点，只有ODF2显示出可比的结合概率。ODF2基因编码多种异构体，包括对应于中心粒蛋白cenexin1的异构体9，它是初级纤毛形成的公认调节因子。
基于这些发现，我们旨在通过功能性靶点验证来剖析plectin和ODF2对PST抗癌效应的相对贡献。在此过程中，我们还揭示了ODF2在HCC相关过程中先前未被认识的作用，包括肿瘤发生、集体侵袭和应激信号传导。为此，我们首次系统分析了在缺乏plectin或ODF2的基因编辑人HCC细胞中的PST反应，以确定这两个已鉴定的相互作用因子是否存在是PST发挥其抗肿瘤活性所必需的。
2 材料与方法
（此部分详细描述了患者数据分析、细胞培养、Plecstatin处理、蛋白质印迹、软琼脂锚定非依赖性生长实验、随机迁移细胞形态分析、划痕愈合实验、球体侵袭实验、Matrigel Transwell侵袭实验、SNU-475细胞培养的蛋白质组学分析（包括样品制备、LC-MS/MS分析和蛋白质鉴定）、抗体与试剂、CRISPR介导的plectin和ODF2靶向、免疫荧光和纤毛发生分析、细胞色素c释放的免疫荧光分析以及统计分析方法。具体实验步骤和条件见原文。）
3 结果
3.1 ODF2成为PST在HCC中抗癌活性的潜在介质
为了研究PST抗癌效应的分子机制，我们首先检验了ODF2的表达是否在HCC中发生改变，类似于其已知靶点plectin。对包含12个独立HCC患者数据集的公共元队列分析显示，ODF2mRNA在肿瘤组织中表达升高，并且与晚期TNM分期和较差的总生存期相关。接下来，我们探索了ODF2表达与HCC致癌发生相关转录程序的关系。高ODF2表达水平与增殖相关特征、线粒体和凋亡信号以及关键的机械感应相关通路显著相关。最后，使用肝脏单细胞图谱分析显示，plectin和ODF2主要在恶性细胞群中表达。这些数据表明，PST在HCC肿瘤微环境中的主要靶点可能是恶性细胞。
3.2 选择性功能缺失揭示plectin是PST抗肿瘤效应的关键介质
为了评估plectin和ODF2对PST介导的抗肿瘤活性的个体贡献，我们选择了携带TP53和TERT突变的HCC细胞系SNU-475。利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑，我们生成了ODF2KO细胞及相应的同基因对照（WT），并纳入了先前建立的PLECKO细胞。成功的基因敲除通过免疫印迹和免疫荧光分析得到验证。使用软琼脂实验评估PST反应，结果显示，虽然ODF2KO细胞显示出降低的基础集落形成，但其对PST的剂量依赖性反应与WT细胞密切相关，表明ODF2对于PST介导的生长抑制是可有可无的。相比之下，PLECKO SNU-475细胞对PST几乎无反应。这些发现表明PST的抗肿瘤功效主要是通过plectin抑制介导的。
3.3 Plectin而非ODF2介导PST驱动的HCC迁移和侵袭抑制
基于ODF2表达与肿瘤进展和转移相关的观察，我们接下来研究了PST的抗侵袭效应是否通过plectin、ODF2或两者介导。划痕愈合实验表明，PST以剂量依赖的方式降低ODF2KO和WT SNU-475细胞的迁移速度，但对PLECKO细胞没有可检测到的影响。一致地，PST处理显著降低了表现出极化形态的WT细胞比例。在3D球体侵袭实验中，PST剂量依赖性地抑制了ODF2KO和WT SNU-475细胞的侵袭，但不影响PLECKO细胞，再次证实了plectin的必要性。这些结果共同证明，PST主要通过抑制plectin的促迁移和促侵袭功能来抑制HCC的播散。
3.4 PST介导的ODF2依赖性纤毛发生破坏
尽管ODF2表达与HCC患者的不良预后和增加的肿瘤发生性相关，但我们的功能分析并不支持ODF2在介导PST抗肿瘤或抗侵袭效应中起主要作用。为了探索PST是否可能影响与肿瘤进展相关的替代性ODF2依赖性通路，我们进行了基于质谱的鸟枪法蛋白质组学分析。基因本体论（GO）富集分析显示，在未处理的WT与PST处理的WT SNU-475细胞中，基于与WT对PLECKO和WT对ODF2KO的共享聚类分析，有两个主要的生物过程簇：与细胞分裂、凋亡、细胞死亡以及内质网和线粒体功能相关的进程，以及与细胞骨架组织、微管和肌动蛋白细胞骨架以及细胞极性建立或维持相关的进程。对共享蛋白质的分析发现，大量失调蛋白质是PST处理的ODF2KO和WT细胞所共有的。为了剖析PST反应中的ODF2特异性成分，我们对ODF2KO与WT以及PST处理的WT与WT之间共享的失调蛋白质进行了GO富集分析，同时排除了在PST处理的ODF2KO细胞中改变的蛋白质。在顶级富集条目中，我们确定了与“纤毛体形态发生”以及“凋亡过程”和“细胞死亡”相关的ODF2靶向子集。为了验证这一纤毛相关特征，我们评估了PST对初级纤毛形成的影响。与预期一致，ODF2KO细胞与WT和PLECKO细胞相比，显示出显著降低的基线纤毛发生。PST处理导致WT和PLECKO群体中纤毛细胞的剂量依赖性减少，而ODF2 KO细胞没有显示出进一步的减少，证实了PST以ODF2依赖的方式抑制纤毛发生。
3.5 PST诱导的整合应激反应与凋亡相关，依赖于plectin和ODF2
PST先前已被证明可诱导ISR、线粒体应激和凋亡。鉴于ODF2在PST介导的迁移和侵袭中缺乏参与，以及我们的蛋白质组学证据表明PST诱导的ISR通路中存在ODF2依赖性成分，我们接下来检查了这种情况下的ISR激活。为了评估ISR状态，我们分析了PST处理和未处理的WT、PLEC KO和ODF2 KO SNU-475细胞中eIF2α丝氨酸51的磷酸化。PST处理显著增加了WT细胞中的eIF2α磷酸化，而PLECKO和ODF2KO细胞均显示出显著减弱的反应。我们接下来检查了PST处理是否影响ATF4和GADD34的水平。PST处理显著增加了WT细胞中ATF4和GADD34的水平。与在eIF2α磷酸化上观察到的效应一致，PST诱导的ATF4和GADD34上调在PLECKO和ODF2KO细胞中被减弱。为了加强所提出的ISR机制的临床相关性，我们分析了公开可用的HCC患者数据集，并进行了plectin和ODF2表达水平与已建立的ISR相关基因特征之间的相关性分析。较高的plectin和ODF2表达均与多个ISR相关基因特征呈正相关。为了确定PST是否在SNU-475细胞中诱导凋亡，我们评估了cleaved PARP（cPARP）的水平。正如预期，PST处理显著增加了WT细胞中的cPARP水平。PST介导的PARP切割需要plectin和ODF2两者，因为cPARP诱导在PST处理的PLECKO和ODF2KO细胞中显著降低。一致地，在WT细胞中，PST处理导致细胞色素c的强劲释放，而在PLECKO和ODF2KO细胞中观察到显著较弱的反应。这些结果表明，plectin和ODF2在调节PST诱导的线粒体应激相关凋亡中协同作用。
4 讨论
解读金属基候选药物的作用机制和靶点特异性仍然是一个关键挑战。在这项研究中，我们剖析了钌基前药PST的抗癌机制，特别关注其对plectin和ODF2的选择性。我们的研究确定，PST在HCC细胞中的主要抗肿瘤发生和抗侵袭效应是通过plectin而非ODF2介导的。使用CRISPR/Cas9为基础的基因编辑，我们证明plectin缺陷消除了PST诱导的锚定非依赖性生长和2D/3D迁移抑制，而ODF2KO保留了敏感性。这些发现解决了先前关于ODF2贡献的不确定性，并突出了plectin是负责PST在肝细胞癌中治疗效应的主要功能靶点。同时，我们的数据揭示了ODF2在独立于其与PST相互作用的情况下促进肿瘤发生和集体HCC细胞侵袭的先前未被认识的作用。此外，我们确定了plectin和ODF2两者对PST触发的整合应激反应激活的共同贡献。与经典的铂类制剂相比，PST提供了一种绕过DNA结合的蛋白质靶向机制。相对快速的激活动力学可能限制系统性脱靶效应，增强了其作为靶向治疗剂的潜力。在机制上，先前的研究和我们当前的蛋白质组分析支持PST通过破坏plectin介导的细胞骨架组织来发挥其主要的抗癌效应。
5 结论
本研究证明，PST对肿瘤生长和侵袭的强大抗癌效应是由其选择性靶向plectin介导的，没有证据表明ODF2有主要贡献。PST强烈且剂量依赖地抑制野生型和ODF2
