《Equine Veterinary Journal》：Exercise-specific plasma proteomic signatures in racehorses: Candidates for training adaptation and peak load monitoring
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本文通过高通量蛋白质组学技术，系统揭示了赛马在不同训练阶段（初始训练T1、赛季中期调理T2、比赛阶段R）血浆蛋白质组的动态变化规律，鉴定出S100A8/A9、胸腺素β4（TMSB4）、磷酸甘油酸激酶1（PGK1）等关键蛋白可作为监测训练适应与生理峰值负荷的候选生物标志物，为运动生理监控提供了新的分子视角。
背景
赛马和运动马匹在训练和比赛中经历显著的生理适应过程，包括肌肉质量增加、有氧能力提升和抗疲劳肌纤维转化等。然而，驱动这些适应的分子机制尚不完全清楚。传统评估方法如心率、乳酸水平和标准化运动测试虽能提供有用数据，但难以捕捉体内复杂的代谢和应激相关变化。因此，迫切需要识别能够更准确评估训练状态和检测超负荷亚临床迹象的新生物标志物。蛋白质组学作为一种大规模研究蛋白质的技术，为揭示运动诱导的分子变化提供了强大工具。
研究设计与方法
这项体内纵向研究涉及49匹阿拉伯马和纯血赛马，它们接受了标准化的高强度训练。血浆样本在三个阶段的三个时间点采集：休息时（p0）、运动后立即（p1）和恢复30-40分钟后（p2）。三个阶段包括：初始训练（T1）、赛季中期调理（T2）和比赛阶段（R）。研究共分析了314份样本，使用基于串联质量标签（TMT）的定量蛋白质组学和Orbitrap质谱技术。通过多重检验校正（q < 0.05）评估蛋白质丰度变化，并使用STRING和ShinyGO进行通路富集分析。
蛋白质组学分析结果
初始训练阶段（T1）的蛋白质表达变化
与基线（p0）相比，运动后立即（p1）采集的样本中有63种蛋白质满足显著性标准（q ≤ 0.05且|FC| ≥ 1.2），其中54种上调，9种下调。在恢复期（p2）与基线比较中，75种蛋白质符合标准（59种上调，16种下调）。显著上调的蛋白质包括警报素/S100家族蛋白（如S100A8、S100A9、S100A12）、细胞骨架/能量代谢相关蛋白（如原胸腺素α PTMA、磷酸甘油酸激酶1 PGK1、凝溶胶蛋白DCN、肽酰脯氨酰顺反异构酶PPIA、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PD、丝切蛋白1 CFL1）。在p2与p0的比较中，S100A8、S100A9、脂钙蛋白9 LCN9、核结合蛋白1 NUCB1等蛋白的升高持续或增强。p1与p2的直接比较显示，8种蛋白质在p1时上调，6种在p2时上调。功能富集分析表明，这些上调蛋白与FcγR介导的吞噬作用、细菌上皮细胞侵袭、紧密连接信号传导以及中性粒细胞活化、氧化应激反应和细胞骨架调控等生物学过程相关。
赛季中期调理阶段（T2）的蛋白质表达变化
在T2阶段，运动后立即（p1）与基线比较，有27种蛋白质达到显著性标准（26种上调，1种下调）；恢复期（p2）与基线比较，有44种蛋白质符合标准（31种上调，13种下调）。最显著上调的蛋白质包括S100A8、S100A9、S100A12和DCN。蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析显示，肌动蛋白相关蛋白3 ACTR3、CFL1、膜联蛋白A1 ANXA1、S100A8和S100A16是参与细胞骨架重塑、钙信号和先天免疫反应的关键枢纽。基因本体（GO）术语富集于中性粒细胞趋化/迁移、核因子κB NF-κB正向调控、锌螯合、自分泌信号传导和蛋白质亚硝基化等过程。与T1相比，T2阶段的反应更加精细化，显示出更集中的免疫trafficking和屏障/粘附控制。
比赛阶段（R）的蛋白质组反应
比赛阶段引发了最强烈的蛋白质组反应。在p2与p0的比较中，有126种蛋白质达到显著性标准（103种上调，23种下调）。S100轴信号显著增强，包括S100A8、S100A9、S100A12和S100G。其他显著上调的蛋白包括PTMA、谷胱甘肽S-转移酶A3 GSTA3、乙醇脱氢酶1E ADH1E、TMSB4、双功能蛋白D-甘油酸脱氢酶DHDH、PPIA等。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析突出了糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径（PPP）、谷胱甘肽代谢、碳代谢、氨基酸生物合成、药物代谢-CYP、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号传导、长寿调节和FcγR吞噬作用等通路。这些变化反映了高强度运动下的高能量需求、增强的解毒/氧化还原控制、蛋白质稳态和快速的细胞骨架修复信号。
跨阶段比较与候选生物标志物小组
通过比较不同训练阶段，研究确定了一组在训练适应和峰值负荷监测方面具有潜力的候选血浆蛋白。这些蛋白包括免疫/应激传感器（S100A8, S100A9, TMSB4）、抗氧化酶（超氧化物歧化酶1 SOD1, 过氧化氢酶CAT, 谷胱甘肽S-转移酶GST/G6PD）、代谢标志物（PGK1, G6PD, 脂钙蛋白）和结构调节剂（DCN, CFL1）。这些蛋白质在不同阶段和采样时间点表现出持续且一致的调节模式，突出了它们作为生物标志物的潜力。
讨论与意义
本研究揭示了与赛马不同训练和比赛阶段相关的独特蛋白质组学特征。早期训练引发广泛的应激反应，赛季中期适应显示出更精细的调节，而比赛则诱导最强烈的变化，包括高代谢需求标志物和潜在生理峰值负荷的迹象。研究结果支持使用血浆蛋白质组学来识别与运动适应和超负荷相关的循环生物标志物。所提出的候选生物标志物小组可能有助于改进运动表现监测、训练负荷管理和马运动员过度训练的早期检测。鉴于许多应激、免疫和代谢通路的保守性，这些发现可能对包括人类在内的其他物种的运动监测和疲劳评估具有更广泛的转化意义。
局限性与未来方向
本研究的局限性包括品种分布不均、并非所有马匹都完成了每次采样、比赛后立即采样不可行以及可能存在亚临床溶血。TMT定量可能存在比率压缩效应。未来需要在独立样本中进行靶向验证（如PRM/SRM或ELISA），并在更大队列中进行纵向采样，以确定效应大小与动力学、平台方差以及环境/个体修饰因素的关系。整合细胞外囊泡（EVs）分析可能为细胞激活和重塑与循环蛋白标志物出现之间的机制联系提供进一步见解。
