《Small Science》：Preparation and Characterization of Niosomes for Bacteriophage Delivery
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本文系统研究了阳离子辅表面活性剂硬脂酰胺修饰的尼奥索姆（Niosomes）作为纳米载体用于噬菌体（Bacteriophage）递送的潜力。研究通过优化囊泡组成和表面电荷，成功实现了噬菌体的高效封装，并利用动态光散射（DLS）、Zeta电位分析、冷冻电镜（cryo-EM）和病毒滴定等技术对制剂进行了全面表征。结果表明，在硬脂酰胺浓度为4.8 mM时，尼奥索姆能在保持噬菌体活性（10 log PFU mL?1）的同时，显著增强其在极端pH条件下的稳定性（如在pH 1.5下仍保留部分活性）。体外动力学实验进一步证实，封装后的噬菌体（Nio-Ph7）比游离噬菌体具有更强的细菌抑制效果。该工作为利用软质纳米囊泡递送复杂生物制剂提供了新思路，对解决多重耐药菌感染具有重要意义。
引言
尼奥索姆是由非离子表面活性剂和胆固醇组成的多功能纳米载体，可选择性地加入膜稳定剂或辅表面活性剂以增强制剂功能。这些软质纳米囊泡结构已被广泛研究用于封装活性药物成分，实现可控和靶向递送。其两亲性结构使其能够同时包载亲脂性和亲水性化合物，适用于治疗和诊断应用。虽然尼奥索姆的研究传统上集中于小分子（如活性药物成分、蛋白质、肽）和遗传物质，但其递送复杂大分子生物制剂（如噬菌体）的潜力尚未被充分探索。
噬菌体是能够选择性感染和清除细菌宿主的病毒，代表了一类可应对全球多重耐药感染挑战的替代生物疗法。与常规抗生素不同，噬菌体具有自动给药能力，能在感染部位根据细菌宿主的可用性按比例增加其浓度。然而，噬菌体敏感且易受环境条件（如pH、温度、酶降解）的影响而失活。没有合适的制剂，噬菌体可能在到达目标细菌之前失去感染性，限制其疗效。
为克服这些限制，开发能够稳定噬菌体、保护其免受恶劣生物环境影响并增强其治疗潜力的先进递送系统的兴趣日益增长。基于纳米载体的封装提供了一种有前景的策略，可在实现可控释放和靶向递送的同时屏蔽噬菌体免受外部应激源的影响。在各种纳米载体平台中，尼奥索姆提供了可调性、生物相容性和成本效益高的独特组合，使其适用于生物制剂的递送。
本研究重点开发硬脂酰胺修饰的尼奥索姆囊泡，用于封装噬菌体，作为大型生物治疗剂的模型系统。通过优化囊泡组成和表面电荷，旨在增强噬菌体递送。研究进一步评估了制剂的理化特性，评估了对酸性和碱性条件的保护作用，并确定了封装后噬菌体感染性的保留情况。
结果与讨论
尺寸分析
改进的注射方法成功制备了所有制剂，未出现任何不稳定、聚集或污染，表明该设置可在无菌条件下有效制备尼奥索姆。动态光散射用于测定所有样品的流体动力学直径和多分散指数。
天然噬菌体样品的平均流体动力学直径约为200 nm。空白尼奥索姆的流体动力学直径为261-287 nm，多分散指数较低，表明囊泡形成均匀。将噬菌体加入尼奥索姆中，在硬脂酰胺浓度≥4.8 mM时，直径相较于空白尼奥索姆有所增加，甚至在19.2 mM时达到449.3 nm，这可能反映了带负电荷的噬菌体与阳离子尼奥索姆之间的静电相互作用促进了复合物形成或封装。多分散指数值保持在较低水平，在较高的硬脂酰胺浓度下保持单分散群体。
Zeta电位和噬菌体存活率
含有噬菌体的尼奥索姆制剂的稳定性和有效性受其表面电荷的严重影响。本研究评估了不同浓度的硬脂酰胺对尼奥索姆Zeta电位的影响。这种阳离子辅表面活性剂增强了尼奥索姆的静电特性，这对于维持胶体稳定性和防止聚集非常重要。这些结果证明了Zeta电位随浓度增加而增加，将尼奥索姆表面电荷转向极正值。
细菌、噬菌体和空白尼奥索姆的表面电荷最初为负值。将增加量的辅表面活性剂硬脂酰胺加入尼奥索姆制剂中，逐渐将Zeta电位从负值转变为正值，在最高测试浓度下达到+60 mV以上。平行评估了硬脂酰胺对噬菌体存活率的影响。在低浓度下，噬菌体滴度与天然噬菌体裂解液相当，表明中等水平的硬脂酰胺允许噬菌体与尼奥索姆结合而不影响感染性。然而，当硬脂酰胺浓度超过4.8 mM时，观察到存活噬菌体计数下降。
噬菌体滴度在9.6 mM时急剧下降7个对数单位，在19.2 mM时仅剩1 log PFU mL?1的噬菌体。这些发现表明，虽然硬脂酰胺的加入实现了噬菌体与尼奥索姆之间的电荷驱动相互作用，但过高的正表面电荷会使噬菌体结构不稳定，导致存活率丧失。为了研究观察到的噬菌体失活是由于表面电荷还是囊泡形成过程，将空白尼奥索姆与天然噬菌体等比例混合。产生的Zeta电位与封装的噬菌体相当，表明该比例适合研究。混合并孵育1天后未观察到失活或噬菌体滴度降低，表明噬菌体失活不是电荷介导的，而是囊泡形成过程的结果。
为了评估优化制剂的储存稳定性，对Nio-Ph7进行了一个月的监测。直径、Zeta电位和噬菌体存活率与制备后获得的值相当，证实该制剂在此期内保持其理化性质和生物活性。
对选定的制剂进行冷冻电镜分析，以研究添加硬脂酰胺后噬菌体和囊泡形成的行为。Nio-Ph1制剂显示噬菌体位于囊泡附近，表明两者之间最小的直接相互作用。相比之下，基于Zeta电位和滴度分析确定为最佳制剂的Nio-Ph7表现出两种不同的封装模式：一些噬菌体被包裹在较大的囊泡内，而另一些则被囊泡 coat 单独包裹。这些观察结果表明静电相互作用促进了封装。
在最高硬脂酰胺浓度下，噬菌体和囊泡之间发生了强烈的相互作用，导致噬菌体结构破坏，特别是噬菌体尾部从其头部脱离。这种浓度依赖性对噬菌体结构的破坏可能是由囊泡形成过程中的机械应力与高正电荷共同驱动的。这些观察结果表明，增加硬脂酰胺浓度增强了噬菌体-囊泡相互作用，在中等浓度下促进封装，但在较高浓度下导致噬菌体结构破坏。
评估了噬菌体负载的尼奥索姆和游离噬菌体裂解液在宽pH范围内的稳定性。游离噬菌体颗粒在pH 3.0至10.0之间表现出存活能力，滴度持续高于10 log PFU mL?1。然而，暴露于强酸性和高碱性条件导致噬菌体活性完全丧失，突出了天然病毒粒子对极端环境的敏感性。相比之下，封装在Nio-Ph7制剂内的噬菌体在更宽的pH范围内保持了显著的稳定性，甚至在极端酸性条件下，滴度下降了约5个对数单位，表明尼奥索姆载体具有显著的保护作用。
为了进一步评估酸性应激下的稳定性，在pH 1.5下监测了Nio-Ph7滴度损失的动力学。观察到噬菌体存活率立即下降，滴度在时间零时从10降至7 log PFU mL?1，在前20分钟内进一步降至6 log PFU mL?1。继续孵育导致进一步逐渐下降，最终在60分钟时达到约6 log PFU mL?1。这些结果表明，虽然极端酸度诱导感染性噬菌体计数显著减少，但尼奥索姆封装与未制剂化噬菌体相比仍提供了有意义的保护。
体外细菌生长评估
生长曲线代表了基于悬浮液在600 nm波长下通过紫外-可见光谱仪测量的浊度的培养基中的细菌生长。仅含有金黄色葡萄球菌的对照曲线大约在10小时后进入稳定期。当加入噬菌体裂解液时，由于噬菌体对细菌细胞的裂解作用，生长下降。对于10 MOI，Nio-Ph7的衰减比普通噬菌体更陡峭，这可以通过含有硬脂酰胺的空白尼奥索姆曲线来解释。通过比较Nio0和Nio1的曲线，证实硬脂酰胺对金黄色葡萄球菌表现出抗菌特性。因此，测试了Nio-Ph7的稀释度以确定硬脂酰胺的最低抑菌浓度，发现为1.18 μg mL?1，而最低杀菌浓度为118 μg mL?1。
为了避免实验中硬脂酰胺的影响，选择了尼奥索姆的稀释度，使得硬脂酰胺的浓度不会影响细菌生长，对应于0.1 MOI图中的数据。含有和不含硬脂酰胺的空白尼奥索姆不抑制细菌生长，并遵循与金黄色葡萄球菌对照相同的趋势。噬菌体和Nio-Ph7再次显示生长下降；然而，后者的下降更为显著并迅速达到完全抑制。先前关于尼奥索姆介导的抗生素递送的研究表明，与细菌膜融合或与细菌表面紧密接触可以增强抗菌效果。类似地，尼奥索姆可以类似地改善噬菌体与细菌细胞的直接相互作用，同时在递送过程中保护它们免受降解，从而增强噬菌体的抗菌活性。在MOI为0.001时，天然噬菌体和Nio-Ph7的生长曲线重叠，表明在这种极端稀释下尼奥索姆的影响最小。细菌生长在前5小时显著，几乎达到生长平台期。超过这一点，噬菌体活性明显，导致细菌生长逐渐持续下降。
评估了硬脂酰胺对多种细菌菌株的抗菌活性。由于硬脂胺不溶于水，使用空白尼奥索姆作为对照，以确定对各种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株的任何抑制作用。结果表明，硬脂酰胺对所有测试的革兰氏阳性菌均表现出抗菌活性。相比之下，未观察到对革兰氏阴性菌的抗菌活性。这种选择性活性可归因于革兰氏类型的细菌细胞壁差异。革兰氏阴性菌具有外膜和内膜，共同充当保护屏障，阻止硬脂酰胺进入并灭活细菌。相反，革兰氏阳性菌缺乏外膜，但由含有带负电荷的磷壁酸的肽聚糖层组成，这很可能与硬脂酰胺相互作用，破坏膜并导致细胞死亡。
结论
尼奥索姆通过静电相互作用与硬脂酰胺成功配制用于封装噬菌体。高浓度的硬脂酰胺使噬菌体不稳定，而4.8 mM的最佳浓度能够实现有效的封装且不损失噬菌体滴度。在尼奥索姆内的封装增强了噬菌体在极端pH条件下的稳定性，在pH 11下提供完全保护，在酸性pH下提供部分保护。体外动力学表明，尼奥索姆封装的噬菌体比游离噬菌体表现出增强的细菌灭活作用，且独立于硬脂酰胺的抗菌作用。这些发现表明，尼奥索姆封装提高了噬菌体的稳定性和抗菌功效，突出了其作为靶向耐药细菌感染的有前景策略的潜力。
