《Small Science》：Triplet RNA Lipid Nanoparticles for Locoregional Cancer Immunotherapy
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本文系统阐述了利用可电离脂质纳米粒（LNP）递送免疫刺激性双链RNA（pIpC）用于局部癌症免疫治疗的最新进展。研究证实，LNP-pIpC能显著上调T细胞共刺激分子（OX40/CD27）及肿瘤细胞免疫检查点（PDL1/MHC I），并成功构建了包含免疫刺激RNA、mRNA及siRNA的“三重复合”LNP平台。该平台通过协同靶向PDL1，有效逆转了肿瘤免疫抑制微环境，为开发新型局部免疫联合疗法提供了有力证据。
1 引言
核酸药物在癌症免疫治疗中展现出巨大潜力。免疫刺激性核酸（如TLR激动剂、RIG-I激动剂）能够有效激活免疫系统，但其临床应用面临诸多挑战。双链RNA类似物聚肌胞苷酸（pIpC）是一种强效的免疫佐剂，能同时激活内体中的TLR3和胞质中的RIG-I样受体（RLR），如MDA-5，从而诱导I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子的产生。然而，pIpC在血清中易被核酸酶降解，且全身给药易导致过度免疫激活和剂量依赖性毒性。因此，开发能够保护pIpC、实现靶向递送并降低毒性的递送系统至关重要。
可电离脂质纳米粒（LNP）是目前最先进的核酸递送平台，已成功应用于mRNA疫苗和siRNA治疗。LNP能够有效保护核酸免受降解，并促进其胞内递送和内涵体逃逸。本研究旨在利用LNP平台递送pIpC，并探索其与基于核酸的免疫检查点阻断疗法（如mRNA或siRNA）的协同作用，以开发一种高效、安全的局部癌症免疫治疗新策略。
2 结果与讨论
2.1 免疫佐剂pIpC以LNP形式给药时显著抑制肿瘤生长
研究首先利用成熟的LNP配方（Dlin-MC3-DMA、胆固醇、DOPE和C16-PEG2000）成功将pIpC包封入纳米粒中。所制备的pIpC-LNP呈球形，粒径约120.5 nm，包封效率高达78.1%。透射电镜（TEM）图像显示，pIpC-LNP具有混合的层状和反六角相结构。
体外实验表明，pIpC-LNP能够被B16F10黑色素瘤细胞高效摄取，并在胞质中积累。在THP-1单核细胞系中，pIpC-LNP能够显著诱导IRF信号通路激活，而可溶性pIpC则无此效果，证明LNP递送增强了pIpC的免疫刺激活性。
在B16F10荷瘤小鼠模型中，瘤内注射pIpC-LNP（15 μg/次，第7天和第9天）能够显著抑制肿瘤生长，并导致25%的小鼠肿瘤完全消退，而可溶性pIpC或阴性对照LNP则无此疗效。这表明LNP递送系统显著增强了pIpC的抗肿瘤活性。
2.2 瘤内治疗显著改变肿瘤引流淋巴结中T细胞活化标志物
为了探索pIpC-LNP治疗的协同靶点，研究分析了肿瘤引流淋巴结（TDLN）中T细胞活化标志物的表达。结果显示，pIpC-LNP治疗显著上调了CD4+T细胞上的OX40和GITR，以及CD8+T细胞上的CD27。这些分子属于肿瘤坏死因子受体超家族（TNFRSF），是潜在的共刺激靶点。相比之下，抑制性检查点分子（如PD1、CTLA4、LAG3和TIM-3）的表达则无明显变化。这一发现提示，OX40和CD27是pIpC-LNP治疗后T细胞活化的关键标志物，可作为联合治疗的靶点。
2.3 用pIpC-LNP处理癌细胞导致PDL1和MHC I类分子上调
研究进一步评估了pIpC-LNP对肿瘤细胞的直接作用。体外实验发现，pIpC-LNP处理B16F10细胞后，显著上调了细胞表面的免疫抑制分子PDL1和抗原呈递分子MHC I类分子的表达。这种上调是pIpC-LNP特有的，可溶性pIpC或阴性对照LNP均无此效应。PDL1的上调是肿瘤细胞的一种免疫逃逸机制，而MHC I的上调则可能增强肿瘤细胞的免疫原性。因此，靶向PDL1可能是一种有效的联合治疗策略。
2.4 评估与pIpC LNP协同组合的潜在T细胞靶点
基于上述发现，研究构建了表达共刺激分子配体（OX40L和CD70）的mRNA-LNP，以靶向上调的T细胞受体。体外实验证实，B16F10细胞能够被mOX40L和mCD70的LNP有效转染，并表达相应的蛋白。在荷瘤小鼠模型中，瘤内注射mOX40L/mCD70 LNP能够抑制肿瘤生长，但其疗效弱于pIpC-LNP单药治疗。将pIpC-LNP与mRNA-LNP联合使用，并未显示出优于pIpC-LNP单药的协同效应。
2.5 与含有siRNA的LNP联合治疗可适度提高pIpC LNP的治疗效果
鉴于pIpC-LNP能够上调肿瘤细胞的PDL1表达，研究探索了联合使用靶向PDL1的siRNA（siPDL1）的疗效。体外实验表明，将pIpC-LNP与siPDL1-LNP联合使用，能够有效逆转pIpC诱导的PDL1上调，同时保留MHC I的上调。
在荷瘤小鼠模型中，pIpC-LNP与siPDL1-LNP联合治疗（pIpC:siPDL1 = 75:25）显示出最强的抗肿瘤效果，肿瘤体积显著小于pIpC-LNP单药治疗组。这表明，通过siRNA靶向PDL1，能够有效克服pIpC诱导的免疫抑制，实现协同抗肿瘤效应。
2.7 用LNP pIpC治疗后肿瘤和TDLN细胞群的特征
对治疗后肿瘤组织的分析显示，pIpC-LNP治疗组和联合治疗组中，肿瘤浸润淋巴细胞（CD45+细胞）的比例显著增加。此外，联合治疗组中促肿瘤的M2型巨噬细胞比例显著降低。T细胞分析表明，pIpC-LNP治疗诱导了CD8+T细胞的优势浸润（CD4/CD8比值降低），并且TDLN中的T细胞活化标志物CD69表达上调。这些结果进一步证实了pIpC-LNP能够有效激活抗肿瘤免疫应答。
3 结论
本研究成功开发了一种基于临床可接受LNP平台的pIpC递送系统。pIpC-LNP在瘤内注射后表现出强大的抗肿瘤活性，并能上调T细胞共刺激分子和肿瘤细胞免疫检查点。研究证明，pIpC-LNP与靶向PDL1的siRNA-LNP联合使用，能够产生协同抗肿瘤效应，显著优于单药治疗。该研究为开发基于核酸的局部免疫联合疗法提供了新的思路和实验依据。
