《Exploration》：A Bioorthogonal and Programmable Bacterial Delivery System for Spatiotemporally Targeted Therapy of Solid Tumors
1 引言
细胞疗法正迅速成为一类有效的癌症治疗方法，其中免疫细胞在血液恶性肿瘤治疗中表现出色。然而，其在实体瘤中的应用受到免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的阻碍，尤其是在免疫偏好的缺氧核心区域。相反，肿瘤核心区域免疫活性的降低为某些细菌的生长创造了有利的TME，这些细菌具有免疫刺激作用，在缺氧和免疫抑制的TME中优先生长，并能够通过全身给药到达肿瘤。这类肿瘤浸润细菌可被用于通过分泌直接杀死肿瘤细胞或治疗性重塑多种肿瘤类型TME的有效载荷来刺激抗肿瘤免疫。
大肠杆菌Nissle 1917（EcN）是一种益生菌，已成为用于在疾病部位提供治疗效果的工程“智能微生物”的首选底盘。其优势包括遗传可转移性、在人体中经过验证的安全性以及在胃肠道和肿瘤中存活和复制的能力。然而，作为一种兼性厌氧菌，EcN表现出复杂的肿瘤靶向机制。肿瘤的无序血管系统及其趋化因子的分泌阻碍了免疫系统在免疫抑制的TME中清除细菌的能力，从而允许细菌优先生长。同时，先天免疫反应的激活使此类细菌能够通过激活各种先天免疫系统信号通路来进一步刺激免疫系统。
微生物肿瘤治疗的益处常常被对全身递送注射剂的生物分布和活性控制有限的担忧所抵消。具体而言，有文献记载循环细菌在健康组织中定植的案例，例如肝脏、脾脏和体内某些缺氧的干细胞生态位。为了避免损害健康器官，微生物治疗药物必须特异性靶向肿瘤。
生物正交反应是一类在体内具有生物相容性的高效、特异性化学反应，可能为这一挑战提供解决方案。叠氮化物和二苯并环辛炔（DBCO）之间的可点击反应据说是体内生物正交类中最有效的反应之一。它在动物模型系统中展示了实用性，对周围生物环境的干扰极小，为药物储存库（口服或静脉注射）中的系统性重复药物递送提供了许多优势。此外，透明质酸（HA）水凝胶可用于时空定位策略。然而，迫切需要一种安全的叠氮修饰HA（azido-HA）生产方法。安全、高效的可点击HA制剂可用于水凝胶，其可以通过生物正交反应进行交联。因此，迫切需要一种安全的生产azido-HA的方法。将azido-HA和DBCO与EcN结合可用于实现时空肿瘤靶向。在调节微生物功能的可用方法中，使用非侵入性近红外（NIR）辐射允许基于温度的转录调节器在组织深处进行时空控制。具体而言，肿瘤的温度可以在耐受良好的范围内精确升高，这比基于化学、光和辐射的诱导方法具有巨大优势。
本研究报道了一种时空靶向与工程EcN递送系统的组合策略，该策略允许温度敏感的EcN通过肿瘤内注射azido-HA水凝胶在肿瘤中定植。简而言之，在酸性肿瘤条件下，由非侵入性NIR诱导的产气荚膜梭菌穿孔素O（pfo）的释放启动了对肿瘤细胞的穿孔效应，增强了肿瘤抗原释放的扩散，从而激活了多种先天免疫信号通路，包括TLRs、cGAS-STING和NLRs通路。同时，穿孔效应被发现通过破坏免疫抑制来重塑细胞外TME。这种抗原和树突状细胞（DCs）之间串扰的增强促进了CD8+T细胞的浸润并增强了它们的治疗活性。抗体介导的CD8+T细胞耗竭抵消了抗肿瘤效应，表明系统性肿瘤消退是由适应性免疫反应引起的。在癌症模型中，azido-HA控制的治疗性微生物在NIR原位成功激活，诱导了显著的肿瘤生长抑制。该策略不仅克服了免疫抑制性TME，而且在实体瘤的免疫治疗中比放疗或化疗介导的肿瘤抗原释放更充分地激活了免疫反应。该技术有望为各种生物和临床场景中强效细菌疗法的时空靶向提供关键工具。
2 结果
2.1 能够捕获工程微生物的时空特异性可点击HA水凝胶的生物合成
为了实现细菌的时空定位，通过靶向代谢标记，使用重组枯草芽孢杆菌生物合成了可点击的HA。来自多杀性巴斯德菌的透明质酸合酶（pmHAS）因其对UDP-N-叠氮乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAz）底物的耐受性而被采用。然而，作为一种细胞质糖基转移酶，pmHAS需要额外的转运蛋白来输出合成的多糖。重组细菌中pmHAS对可点击HA的细胞内生产使得多糖纯化变得困难，限制了体内应用。因此，我们寻求使用类似策略将可点击HA作为细胞外多糖进行生物生产。值得注意的是，天然细菌HA多糖是由革兰氏阴性多杀性巴斯德菌A型和革兰氏阳性A群和C群链球菌产生的。在此基础上，我们选择来自兽疫链球菌的HA合酶（szHasA）作为重组细胞中的聚糖聚合酶，以取代pmHAS。
我们设计并构建了具有以下特征的重组枯草芽孢杆菌菌株：（1）诱导表达外源szHasA；（2）删除UDP-GlcNAc的从头生物合成；（3）组成型表达UDP-GlcNAz补救途径。最终的枯草芽孢杆菌菌株（基因型GlmSΔ-NahK-AGX1-szHasA-168）被命名为枯草芽孢杆菌168SSHA。
枯草芽孢杆菌168SSHA被培养以生产azido-HA。我们的数据还表明，UDP-GlcNAz是szHasA的β1-3 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的合适供体底物。纯化的azido-HA能够捕获循环的生物正交分子并将其保持数周，表现出补充能力。将azido-HA与四臂聚乙二醇胺-四二环壬炔（PEG-tBCN）交联，创建了一种可注射的N3-CHA 1水凝胶，具有最佳的粘度、可注射性和叠氮基团保留。分子量和结构分析证实了成功的交联。与未交联的azido-HA相比，N3-CHA 1在注射部位停留时间更长，且不会引起炎症。这种增加的保留时间和生物相容性突出了N3-CHA 1作为一种可点击激活的药物递送系统的潜力，该系统可以多次重新捕获细菌。总的来说，交联的azido-HA水凝胶值得作为可持续、可补充药物递送的创新平台进行进一步研究。
2.2 生物正交策略使细菌在肿瘤中实现有利的、受调控的时空定位
为了实现细菌疗法的时空定位，我们利用生物正交反应的原理来精确捕获肿瘤中的EcN。具体而言，我们在体外实现了EcN的有效DBCO标记。这种标记方法能够对不同批次的EcN进行完全的DBCO标记，并至少维持100分钟，确保了标记的均匀性和稳定性。为了可视化细菌的生物分布，设计并构建了生物发光的EcN-luxCDABE菌株。
微流体模拟测定表明，在N3-CHA 1水凝胶的辅助下，DBCO标记的EcN-luxCDABE穿过血管并保留在含有azido-HA水凝胶的上培养室一侧，而未标记的EcN-luxCDABE无法在上室定植。在第12分钟时，DBCO-EcN-luxCDABE的生物发光强度显著高于未标记的EcN-luxCDABE。同时，在双侧肿瘤模型中，发现DBCO标记的EcN-luxCDABE在开始时分布在两个肿瘤中，这是因为肿瘤的缺氧和免疫抑制特性。然而，与注射普通HA的肿瘤相比，DBCO-EcN-luxCDABE在注射了N3-CHA 1的肿瘤中被特异性富集并持续了更长时间。值得注意的是，在8天的治疗期间，对肿瘤中EcN上DBCO标签动态变化的测量显示，尽管荧光强度逐渐降低，但可点击细菌的数量增加了，这表明一些DBCO修饰仍然保留在后代EcN的表面。由于EcN的天然肿瘤趋向性以及azido-HA水凝胶在肿瘤部位捕获DBCO-EcN的能力，体内靶向实验证实，EcN的生物分布仅发生在N3-CHA 1肿瘤部位，与HA注射的肿瘤相比，细菌没有在其他器官中错误分布。我们还研究了在肿瘤内注射N3-CHA 1后直接肿瘤内注射DBCO-EcN-luxCDABE的效果，发现与静脉注射相比，细菌未能实现肿瘤的长期定植。此外，我们的研究结果表明，DBCO分子附着在EcN的荚膜多糖肝素上。DBCO在EcN?KfiC上没有被有效标记，这表明肝素的存在对于时空定位至关重要，类似于azido-HA。
为了测试肿瘤内EcN反应的调节，我们首先评估了肿瘤的酸性环境作为报告基因表达改变的条件。工程改造的EcN-pCadC-mCherry菌株携带在启动子pCadC控制下的红色荧光mCherry报告基因，该启动子受膜锚定激活蛋白（CadC）调节，该蛋白在酸性pH的培养基中表现出比中性pH更高的活性。使用癌症球体模型，我们发现EcN-pCadC-mCherry不仅在肿瘤中诱导了mCherry的表达，而且有效地渗透了含有N3-CHA 1水凝胶的实体瘤的核心区域。这表明确酸条件下肿瘤球体与EcN的共定位。然后，我们观察到N3-CHA 1水凝胶可以利用其优势吸引工程细菌。我们还评估了EcN的药代动力学。在肿瘤内注射N3-CHA 1水凝胶和静脉注射DBCO-EcN-luxCDABE后，肿瘤中的EcN-luxCDABE细胞数量在第4天达到峰值，随后随着代谢清除逐渐减少，并且没有脱靶效应，重要的是证明了细菌疗法的生物安全性。此外，当在第7天重复EcN注射时，肿瘤中的细菌数量在第13天再次达到峰值。
2.3 时空靶向EcN-pfo终结者（STEPT）介导的时空可调节有效载荷释放显示出强大的治疗潜力
在实现肿瘤靶向细菌治疗后，我们的下一步是利用EcN作为控释活性物质的载体。因此，我们修改了STEPT系统，通过采用合成生物学工具来精确调整EcN与环境之间的相互作用，从而在实体瘤中实现活性抗肿瘤有效载荷的受控释放。
我们设计了感知并响应肿瘤酸性环境和局部升温（通过NIR）变化的基因回路，从而自主调节细菌有效载荷的释放。这提高了STEPT介导的细菌癌症治疗对实体瘤的安全性和有效性。最终的EcN菌株被命名为EcN-pfo，它分泌来自产气荚膜梭菌的细胞毒性分子pfo。pfo的表达可以通过使用诱导型启动子来更精确地控制，这有助于避免对正常组织的毒性。在肿瘤的酸性条件下，EcN-pfo诱导pCadC驱动的携带基质金属蛋白酶（MMP）切割位点的pfo前体蛋白的表达。这些位于肿瘤中的细菌开始表达pfo前体蛋白，该蛋白分布在周质空间和外膜中。注射后第4天，对肿瘤施加NIR，将局部肿瘤温度升高至42°C，从而触发温度敏感磷酸酶（phoA）和细菌素释放蛋白（BRP）的表达。作为与细菌素释放相关的蛋白质，phoA和BRP增加了细菌外膜的通透性，并促进pfo前体释放到TME中，在那里它们被MMP切割以释放pfo。单体pfo与肿瘤细胞膜上的胆固醇结合，聚合成具有穿孔作用的聚合物，直接导致肿瘤细胞死亡。
结合NIR照射以精确控制肿瘤部位的温度，我们工程改造了一种具有mCherry报告基因表达的温度敏感菌株，以直接反映肿瘤内细菌的温度响应。温度敏感启动子对温度极其敏感，只有当温度达到42°C时才会激活系统。患者的发烧温度不会达到42°C，因此不会触发系统。最佳的NIR条件是0.308 W/cm2在5 cm处进行三轮周期性照射，5分钟开启和5分钟关闭。我们将细菌-水凝胶组合命名为：时空靶向EcN-pfo终结者（STEPT）。STEPT系统具有很强的pfo分泌和表达能力，以及肿瘤杀伤能力。此外，我们观察到STEPT系统在一定程度上降解了肿瘤的物理屏障，并增强了光声信号。这些观察结果表明，细菌通过积聚在肿瘤血管附近发挥破坏作用，导致肿瘤血栓形成和光热吸收增加。接下来，我们比较了静脉注射和肿瘤内注射细菌在肿瘤内的分布。通过肿瘤内注射，细菌数量在短时间内迅速增加，定植能力较弱，细菌主要分布在远端肿瘤血管的坏死区域。相比之下，静脉注射的细菌分布在近端和远端肿瘤血管中。细菌主要积聚在肿瘤血管附近，细菌分泌的pfo迅速杀死肿瘤并诱导肿瘤血管破坏，导致肿瘤血栓形成。随后，细菌表现出长期定植扩张。为了更好地可视化肿瘤内细菌的分布，我们计划在未来在单细胞水平上表征这种分布。我们将使用侵袭-粘附定向表达测序（INVADEseq）方法，利用10×条形码识别具有细胞内细菌的单个细胞。值得注意的是，N3-CHA 1的存在有助于增加EcN-pfo的耐受剂量，提高了STEPT系统的安全性和有效性。
2.4 STEPT在肿瘤模型中的抗肿瘤疗效和安全性
使用WEHI164肿瘤小鼠模型并遵循治疗时间表，研究了STEPT系统对纤维肉瘤生长的作用。将小鼠随机分为五组，包括G-STEPT组、G1组、G2组、G3组和G4组。结果显示，各组在第一天的肿瘤体积相似。然而，G-STEPT组表现出最强的肿瘤生长抑制作用，无差别地攻击肿瘤细胞，并强效抑制肿瘤生长，表现为肿瘤缩小、变黑和结痂，平均肿瘤体积和质量显著减少，生存时间最长。在其他治疗组中，肿瘤体积超过500 cm3。G1组和G2组仅表现出轻微的抗肿瘤作用，这可能归因于少量EcN-pfo自发分布到肿瘤组织。此外，我们发现NIR本身对TME中的肿瘤细胞没有显著影响。
STEPT系统对纤维肉瘤的优异效果鼓励我们进一步研究其在转移性乳腺癌肿瘤模型中的抗肿瘤作用。正如预期的那样，STEPT系统有效抑制了乳腺癌的发展并控制了肿瘤转移。值得注意的是，STEPT治疗有效抑制了肿瘤的肺和肝转移，这反过来有助于延长生存期并实现了完全缓解。由于STEPT系统中的EcN-pfo仅定植于肿瘤部位，这些细菌可能对肿瘤细胞中的原生生态微生物产生了影响。我们的STEPT疗法可能导致介导肿瘤转移的肿瘤原生微生物死亡和极度减少，改变了肿瘤内的微生物生态位。
此外，STEPT系统对大型肿瘤表现出一定的有效性，并且未来可以与癌症疫苗、过继性T细胞转移和嵌合抗原受体T细胞疗法联合使用。
我们还评估了STEPT系统的安全性，发现尽管肿瘤质量与EcN-pfo的定植不呈线性相关，但N3-CHA 1显著增加了肿瘤部位EcN-pfo的丰度。在体内同时施用静脉或口服头孢克肟与EcN-pfo，在2天或4天内完全消除了这些细菌。STEPT治疗后，与健康小鼠相比，体温和体重几乎没有变化。生理和生化指标在STEPT治疗后也正常，除了血小板计数有轻微波动。我们还排除了肝素诱导的血小板减少症的可能性，并确定平均血小板体积或血小板聚集没有显著变化。总的来说，我们的STEPT系统被发现是安全的。
2.5 STEPT产生的抗原通过DC递送扩散并激活CD8+T细胞，从而介导抗肿瘤免疫
研究STEPT治疗对免疫系统的影响已成为我们下一个合理的目标。与其他组相比，G-STEPT组在14天时显示出CD8+T细胞的比例和数量增加，而对CD4+T细胞影响很小。产生干扰素γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的CD8+T细胞也得到扩增，而CD4+T细胞几乎没有变化。然后，我们通过流式细胞术分析早期、中期和晚期时间点的免疫反应，评估了STEPT治疗在整个肿瘤发展过程中的全身免疫调节后果。我们发现STEPT治疗在TME中诱导了一种抗肿瘤的、免疫刺激的环境，其特征是第6天产生IFN-γ的CD4+T辅助细胞1（Th1）的扩增，以及所有评估时间点的CD8+1型细胞毒性T（Tc1）细胞。这些CD8+T细胞活跃增殖，表现为Ki67表达上调。抑制性免疫检查点分子程序性死亡1（PD-1）和T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域包含分子3（TIM-3）不受该STEPT方案的影响，表明它选择性地介导了TME中的T效应细胞反应。
尽管G-STEPT治疗影响了某些先天免疫细胞类型的频率和/或绝对数量，但这些变化并不一致。然而，肿瘤中抗原呈递DCs的浸润显著上调。此外，G-STEPT治疗显著触发了更多抗原特异性DCs和淋巴结中的活化DCs，表明DCs通过STEPT治疗在淋巴结中成熟。我们还发现NIR本身对TME中的免疫细胞没有显著影响。
由于细菌激活先天免疫反应的性质，我们使用抑制剂来研究STEPT系统触发的信号通路，包括TLRs、cGAS-STING、NOD1和NLRP3通路，以及它们在STEPT诱导的DC成熟中可能的作用。结果显示，单独使用TLR2抑制剂C29、TLR4抑制剂resatorvid、cGAS-STING抑制剂H-151、TLR7/9抑制剂硫酸羟氯喹、NOD1抑制剂NOD-IN-1或NLRP3抑制剂CY-09处理，部分抑制了STEPT诱导的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的成熟。TLR5抑制剂TH-1020处理没有显著效果。这些发现表明，STEPT通过激活TLR2、TLR4、TLR7/9、cGAS-STING、NOD1和NLRP3通路来刺激BMDCs。
此外，在体内进行的耗竭研究表明，CD8+T细胞对于STEPT治疗介导的肿瘤抑制至关重要，这与CD4+T细胞不同。值得注意的是，研究表明基质粘弹性的调节可以诱导T细胞的功能差异，在慢松弛基质中培养显示出最高的杀伤力。因此，我们研究了肿瘤中的N3-CHA 1水凝胶改变T细胞活性的可能性。已知活化蛋白1（AP-1）家族转录因子c-Jun的上调与T细胞活化相关。我们发现，在与交联水凝胶孵育后，CD8+T细胞中c-Jun过表达，表明交联的azido-HA可能具有拯救耗竭T细胞和增强T细胞活性的潜力。接下来，我们评估了G-STEPT治疗后肿瘤负荷与CD8+T细胞之间的关系。在G-STEPT治疗的小鼠中，肿瘤浸润性IFN-γ+CD8+T细胞频率的增加与肿瘤负荷的减少密切相关，但在对照组小鼠中则不然。这些发现支持了STEPT治疗诱导的CD8+T细胞对于控制转移性肿瘤很重要的假设。基于此分析，STEPT系统似乎通过DCs的抗原呈递效应触发了抗肿瘤CD8+T细胞的活化，表现出强大的抗肿瘤活性。
研究表明，常规1型树突状细胞中的穿孔素-2有助于将细胞相关抗原交叉呈递到细胞质中。Pfo可能在免疫抗原呈递中发挥与穿孔素-2相同的作用。我们观察到，少量没有明显细胞杀伤作用的EcN-pfo分泌的pfo与BMDCs中的吞噬体共定位。在插入BMDCs细胞外膜之前，pfo与肿瘤抗原一起被吞噬到吞噬体中。Pfo可以穿孔细胞内囊泡，导致吞噬体膜局部破裂，从而加速T细胞的启动。这与我们观察到的pfo增强了细胞内吞区室的“渗漏性”一致。
与之前的研究一致，DCs分泌白细胞介素-12（IL-12）以激活T细胞，而T细胞来源的IFN-γ反过来触发DCs产生IL-12。这种正反馈信号增强了治疗期间IFN-γ+CD8+T细胞的表达和细胞毒性活性。在乳腺癌荷瘤模型小鼠中，肿瘤部位浸润免疫细胞分泌的细胞因子TNF-α和IL-2也显著上调。然而，血清中炎症相关细胞因子的水平保持稳定。我们进一步评估了STEPT治疗下全身性非器官特异性抗核抗体的诱导。我们发现G-STEPT疗法在任一肿瘤模型中均未诱导ANA，表明该治疗未诱导全身性自身免疫。
此外，我们还发现，使用STEPT系统成功激活CD8+T细胞需要静脉注射可编程EcN和肿瘤内注射可点击水凝胶。此外，在缺乏肝素的情况下，DBCO-EcN-pfo的抗肿瘤能力大大降低。
2.6 STEPT治疗的免疫记忆提供长期抗肿瘤保护
为了研究G-STEPT治疗对小鼠长期免疫记忆的益处，我们诱导了4T1-luc肿瘤的形成。当完全缓解者在第61天再次受到4T1-luc细胞攻击时，发现接受STEPT治疗的小鼠没有经历肿瘤复发，并且对再次攻击具有抵抗力。相比之下，作为对照的肿瘤内注射DBCO-EcN-pfo治疗的4T1-luc荷瘤小鼠模型，在注射同一批4T1-luc细胞后一周内就出现了肿瘤。在第93天分离的脾细胞流式细胞术分析显示，G-STEPT治疗中效应记忆T细胞和中央记忆T细胞的比例高于G5组。同时，脾脏中CM的比例高于EM。总的来说，这些结果证实了STEPT治疗有效诱导了免疫记忆，这对于长期预防肿瘤复发至关重要。
我们还研究了G-STEPT治疗是否可以延迟未经治疗肿瘤的生长。我们观察到STEPT治疗增强了治疗肿瘤中肿瘤浸润T细胞的功能，这使我们假设癌症的持久缓解不仅需要消除治疗过的肿瘤，还需要全身性抗肿瘤免疫力来清除远处转移。在未经治疗的肿瘤中，效应记忆T细胞的比例高于中央记忆T细胞，表明中央记忆T细胞转化为效应记忆T细胞，并增强了效应记忆CD8+T细胞的肿瘤基础活性。这些数据表明，STEPT治疗诱导的T细胞表型变化可能解释了它们对远端肿瘤增强的能力。基于这种机制，STEPT系统可以产生强大的CD8+记忆T细胞，预防肿瘤复发，同时抑制远处“冷”肿瘤。
在STEPT系统中，整个肿瘤战斗过程涉及细菌、癌细胞和免疫细胞之间的相互作用。在治疗的初始阶段，pfo分子迅速释放，无差别地杀死癌细胞，导致强效的肿瘤生长抑制以及肿瘤缩小和结痂。暴露的肿瘤抗原被DCs加工和呈递，触发了由T细胞介导的适应性肿瘤特异性免疫反应。同时，工程细菌通过激活多种先天免疫系统信号通路进一步刺激DCs，包括本研究中的TLRs、cGAS-STING和NLRs。然后，抗原特异性CD8+T细胞识别并攻击局部治疗过的肿瘤中的肿瘤细胞，以及远处的肿瘤细胞。该系统产生了有效的疫苗样免疫记忆，有利于抑制肿瘤复发和转移。
3 讨论
为了解决细菌系统性递送和微生物治疗有效载荷的局限性，我们设计了一种用于工程大肠杆菌的时空靶向系统，该系统由生物生产的叠氮修饰HA水凝胶控制。这种时空定位策略被称为STEPT，用于精确调整细菌与宿主环境之间的相互作用。该系统具有传感器和响应器基因回路，可自主调节TME中有效载荷的释放，旨在提高癌症治疗的有效性和安全性。除了靶向实体瘤外，STEPT还被发现可以抑制肿瘤复发和远处“冷”肿瘤。
azido-HA的安全和高效制备对于STEPT系统的时空定位至关重要。虽然azido-HA可以通过各种化学修饰获得，但使用化学策略对HA进行叠氮取代的程度通常较低，并且纯化可能很困难。这可能导致副产物的排斥或在临床使用中出现意外的生理毒性。相比之下，发酵衍生的azido-HA可以使用公认安全的微生物获得，并具有高叠氮取代度和丰富可点击位点的优势。
更关键的是，DBCO-EcN-pfo与原位N3-CHA 1的结合可能创建一个聚合物间隔物，阻止EcN-pfo、癌细胞和免疫细胞之间的细胞间相互作用。DBCO-EcN-pfo通过与叠氮化物的点击反应，利用N3-CHA 1水凝胶作为间隔屏障，这为工程细胞在实验初始阶段免疫细胞激活之前不被清除提供了治疗机会，为DBCO-EcN-pfo的生长和定植赢得了时间，从而增强了治疗效果。这一特征表明，N3-CHA 1水凝胶和DBCO-EcN-pfo之间的原位生物正交点击反应可能导致更安全的细菌治疗策略。由于肿瘤的复杂性，我们目前正在探索MMP在肿瘤环境中自然存在的条件下切割Lpp-OmpA-pfo成pfo的条件，我们将在未来为此提供证据。
此外，针对实体瘤的过继性T细胞疗法受到肿瘤细胞凋亡抵抗机制和免疫抑制性TME的限制。肿瘤疫苗和细胞疗法的有效性受到启动的T细胞无法穿透肿瘤的限制。因此，我们必须克服免疫疗法的局限性，为实体瘤寻求新的解决方案。STEPT系统可以应对这些挑战。从机制上讲，我们发现STEPT触发了DCs的强大激活，导致启动程序的诱导，以增强内源性T细胞穿透肿瘤。我们推测pfo在破坏肿瘤的物理屏障后，可以从免疫抑制性TME中诱导抗原扩散，这可能有助于抗原扩散。免疫系统可以更明显地识别和攻击肿瘤，这可能在解决肿瘤异质性和肿瘤诱导的免疫抑制方面发挥作用。在未来，我们计划在单细胞水平上进一步表征肿瘤内细菌的分布。我们还旨在探索使用溶瘤细菌策略解决抗原丢失介导的肿瘤逃逸和肿瘤抗原异质性的方法。然而，还需要进一步的工作来阐明STEPT治疗期间发生的肿瘤和免疫系统变化的机制，并优化治疗方法。此外，这种优化应旨在扩大STEPT作为安全、有效的实体瘤治疗策略的应用。
细菌疗法的最大优势在于其遗传灵活性，能够实现个性化治疗和靶向特定肿瘤部位。一旦完善，抗癌细菌有望成为必不可少的临床工具，能够在抑制和治疗肿瘤方面发挥作用。同时，与非常昂贵的传统免疫细胞抗癌疗法相比，溶瘤细菌可以通过简单、可持续的过程以低成本生产。这有望极大地提高临床癌症治疗的可及性。任何新疗法从实验室到临床的转变都需要付出巨大的努力，本研究证明了STEPT策略在提高工程细菌在肿瘤中聚集效率方面的可行性
