《Scientific Reports》：Utility of plasma MicroRNA profiling as diagnostic biomarker in immune system activation and inflammation and early predictor of severity in patients with COVID-19
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本研究旨在解决COVID-19患者早期诊断及预后分层困难的问题。研究人员通过血浆miRNA谱分析，发现miR-133a-3p和miR-545-3p组合可有效区分COVID-19与非COVID-19患者（AUC=0.867），而miR-142-3p和miR-423-3p组合则能早期预测患者发展为呼吸衰竭的风险（AUC=0.931）。该研究为COVID-19的精准诊疗提供了非侵入性的生物标志物新策略。
研究背景：从“感冒”到“风暴”，COVID-19的临床迷雾
自2019年底以来，新型冠状病毒病（COVID-19）已席卷全球，造成数亿人感染和数百万死亡。尽管疫情已进入常态化阶段，但该疾病对全球公共卫生的威胁依然存在。临床上，COVID-19的表现千差万别，从无症状感染、轻微的上呼吸道症状，到迅速恶化的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、脓毒症休克和多器官功能衰竭，其临床谱系极为宽广。
对于急诊科医生而言，最大的挑战之一是如何在患者就诊的早期，准确识别出那些看似病情稳定、但实则“暗流涌动”的高危患者。这些患者可能在入院后数小时或数天内迅速出现呼吸衰竭，需要无创通气（NIV）甚至气管插管（IOT）等高级生命支持。目前，临床常用的炎症指标如C反应蛋白（CRP）和淋巴细胞计数虽然有一定参考价值，但其敏感性和特异性有限，难以实现精准的早期预警。
因此，寻找能够客观反映疾病本质、且能在疾病早期就发出“警报”的生物标志物，成为改善COVID-19患者管理的关键。近年来，随着“组学”技术的飞速发展，科学家们将目光投向了微小的非编码RNA——MicroRNA（miRNA）。
为什么是MicroRNA？
MicroRNA是一类长度约22个核苷酸的小分子RNA，它们不编码蛋白质，却在基因表达的“后加工”环节扮演着“调控大师”的角色。它们能够与特定的信使RNA（mRNA）结合，抑制其翻译成蛋白质，从而精细调控细胞的生理和病理过程。
更令人兴奋的是，miRNA不仅存在于细胞内，还会被释放到血液、尿液等体液中，形成“循环miRNA”。这些循环miRNA非常稳定，易于检测，并且其表达谱会随着疾病的发生发展而发生特异性改变。因此，它们被视为极具潜力的“液体活检”生物标志物，可用于疾病的诊断、预后判断和疗效监测。
在COVID-19中，已有研究报道了患者血浆中miRNA谱的改变。然而，这些研究大多侧重于区分COVID-19患者与健康人，或者比较重症与轻症患者。对于急诊科医生来说，一个更实际、更具挑战性的问题是：如何将COVID-19患者与其他症状相似但病因不同的患者（如流感样综合征、细菌性肺炎等）区分开来？以及，如何从一群入院时症状相似的患者中，精准地揪出那些未来会恶化的“潜力股”？
为了回答这两个核心问题，来自意大利都灵大学的研究团队开展了一项前瞻性研究，旨在探索血浆miRNA谱在COVID-19诊断和早期预后预测中的双重价值。
关键技术方法概览
为了回答上述科学问题，研究人员设计并执行了一套严谨的实验流程，主要包含以下几个关键环节：
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前瞻性队列构建：研究纳入了40名因急性症状（如发热、呼吸困难、咳嗽等）就诊于急诊科的患者。通过RT-PCR检测和专家临床评估，最终确定30名为COVID-19患者，10名为非COVID-19患者（如流感样综合征、细菌性肺炎等）。此外，还招募了10名健康受试者作为对照。在COVID-19患者中，根据住院期间是否发展为呼吸衰竭（定义为需要增加氧疗、无创通气或气管插管），进一步分为预后良好组和预后不良组。
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miRNA高通量筛选与验证：研究采用了两步法策略。首先，利用TaqMan Human microRNA Arrays对754种miRNA进行高通量筛选，以发现差异表达的候选miRNA。随后，通过单管实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对筛选出的候选miRNA进行独立验证，确保结果的可靠性。
- 3.
生物信息学分析：为了理解差异表达miRNA的生物学意义，研究人员利用multiMiR等生物信息学工具，预测了这些miRNA的靶基因，并进行了KEGG和WikiPathways通路富集分析，以揭示其可能参与的生物学过程。
- 4.
统计学与诊断效能评估：采用Mann-Whitney检验等统计方法比较组间差异。通过绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线）并计算曲线下面积（AUC），评估了单个或组合miRNA在诊断和预后预测中的准确性。
研究结果：解码血浆中的“分子指纹”
1. 患者特征与临床基线
研究共纳入50名受试者，包括10名健康受试者（HS）、10名非COVID-19患者和30名COVID-19患者。三组人群在年龄、性别分布上基本匹配。实验室检查显示，COVID-19患者表现出典型的炎症特征，包括淋巴细胞计数降低、中性粒细胞/淋巴细胞比值（NLR）升高以及C反应蛋白（CRP）水平显著升高，这与其他研究报道一致，证实了研究队列的代表性。
2. 发现COVID-19的诊断性miRNA标志物
通过高通量miRNA芯片分析，研究人员在COVID-19患者与健康对照者之间鉴定出11个差异表达显著的miRNA。为了聚焦于与COVID-19核心病理生理（即免疫系统激活和炎症）最相关的miRNA，他们进行了通路富集分析。
分析结果显示，这些差异miRNA显著富集于多个关键通路，包括：
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免疫系统炎症：IL-6信号通路、IL-17信号通路、趋化因子信号通路。
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免疫系统激活：T细胞受体（TCR）信号通路、B细胞受体信号通路、自然杀伤（NK）细胞介导的细胞毒性。
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细胞死亡与组织损伤：铁死亡、凋亡。
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代谢与应激：mTOR信号通路、自噬、HIF-1信号通路。
基于这些通路，研究人员锁定了7个候选miRNA进行后续验证。通过qRT-PCR在独立样本中验证，最终确认有4个miRNA在COVID-19患者中表达显著上调，分别是miR-199a-5p、miR-142-3p、miR-133a-3p和miR-545-3p。
3. miR-133a-3p和miR-545-3p：区分COVID-19与非COVID-19的“黄金组合”
为了评估这些miRNA的诊断价值，研究人员进一步比较了COVID-19患者与非COVID-19患者（即其他病因导致的呼吸道感染患者）的miRNA表达水平。
结果发现，miR-133a-3p和miR-545-3p在COVID-19患者中的表达水平显著高于非COVID-19患者。ROC曲线分析显示，这两个miRNA单独使用就具有很高的诊断准确性：
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miR-133a-3p的AUC为0.857，特异性为100%，敏感性为71.4%。
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miR-545-3p的AUC为0.844，特异性为100%，敏感性为55.6%。
然而，研究的亮点在于，将这两个miRNA组合起来进行分析时，其诊断效能达到了顶峰，AUC高达0.867，特异性为70%，敏感性高达94.4%。这表明，miR-133a-3p和miR-545-3p的组合能够更准确地将COVID-19患者与其他病因的呼吸道感染患者区分开来，为急诊科的快速鉴别诊断提供了强有力的工具。
4. 发现预测疾病严重程度的miRNA标志物
研究的第二个目标是寻找能够早期预测COVID-19患者病情恶化的miRNA。研究人员将26名入院时病情相似、但后续结局不同的COVID-19患者分为两组：预后良好组（未发生呼吸衰竭）和预后不良组（发展为呼吸衰竭）。
通过类似的筛选和验证流程，研究人员发现，有4个miRNA的表达水平在预后不良组患者中显著降低，它们是：miR-423-3p、miR-106b-5p、miR-142-3p和miR-369-3p。
5. miR-142-3p和miR-423-3p：预测呼吸衰竭的“预警信号”
ROC曲线分析证实了这4个miRNA的预后预测价值。其中，miR-142-3p和miR-423-3p的组合表现最为出色，其AUC高达0.931，特异性为100%，敏感性为87.5%。这意味着，在患者入院早期，通过检测血浆中这两个miRNA的水平，医生就有很大把握预测出哪些患者未来会发展为呼吸衰竭，从而可以提前进行干预，改善患者预后。
结论与讨论：从“标志物”到“调控者”的深远意义
本研究通过严谨的实验设计和生物信息学分析，系统性地揭示了血浆miRNA谱在COVID-19诊疗中的双重价值。
1. 诊断价值：精准区分，避免误诊
研究发现，miR-133a-3p和miR-545-3p的组合能够有效区分COVID-19患者与其他病因的呼吸道感染患者。这一发现具有重要的临床意义。在急诊科，面对一个发热、咳嗽、呼吸急促的患者，快速确定其是否为COVID-19至关重要，这直接关系到隔离措施、治疗方案和公共卫生管理。传统的核酸检测虽然特异性高，但耗时较长，且无法反映机体的免疫反应状态。而miRNA标志物不仅提供了快速的诊断信息，其表达水平还直接反映了机体对病毒的免疫应答强度。
2. 预后价值：早期预警，抢占先机
更令人振奋的是，研究发现了能够预测疾病严重程度的miRNA标志物。miR-142-3p和miR-423-3p在入院时病情恶化的患者中表达水平显著降低。这一发现为临床医生提供了一个强大的“预警系统”。通过检测这两个miRNA，医生可以在患者出现明显呼吸衰竭迹象之前，就识别出高危人群，从而尽早采取更积极的治疗策略，如加强监护、早期使用抗炎药物或调整呼吸支持方案，最终可能改善患者的生存率。
3. 生物学意义：揭示疾病背后的分子机制
本研究不仅停留在“发现标志物”的层面，还通过生物信息学分析，深入探讨了这些miRNA可能参与的生物学过程。研究发现，与诊断相关的miRNA主要富集于免疫炎症和细胞死亡通路，而与预后相关的miRNA则与Toll样受体（TLR）信号通路、中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成等过程相关。这些发现为理解COVID-19的发病机制提供了新的线索。例如，miR-142-3p已知可以负向调控IL-6的表达，而IL-6是COVID-19“细胞因子风暴”中的关键因子。因此，miR-142-3p的表达下调可能导致IL-6水平失控，进而引发过度炎症反应和组织损伤。
4. 局限性与展望
当然，本研究也存在一些局限性。首先，样本量相对较小，需要在更大规模、多中心的队列中进行验证。其次，研究主要基于相关性分析，这些miRNA究竟是疾病过程的“驱动者”还是“旁观者”，尚需进一步的机制研究来阐明。
尽管如此，这项研究无疑为COVID-19的精准医疗开辟了新的道路。它证明了血浆miRNA谱是一种有前景的非侵入性工具，不仅能够辅助诊断，更能实现早期、精准的预后分层。未来，随着研究的深入，这些miRNA标志物有望被开发成快速检测试剂盒，应用于临床实践，帮助医生做出更明智的决策，最终造福广大患者。
