《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Low density lipoprotein receptor-related protein 8: a critical receptor for tick-borne encephalitis virus entry
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蜱传脑炎病毒(TBEV)缺乏特异性抗病毒药物，其入侵宿主细胞的受体机制尚不明确。本研究通过全基因组CRISPR-Cas9筛选和靶向功能验证，首次鉴定低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)是TBEV的功能性入侵受体。研究揭示了LRP8的LA1-2结构域与病毒E蛋白DIII区的直接相互作用，并证实可溶性LRP8-Fc诱饵蛋白在体内外均能有效抑制病毒感染。该发现为开发靶向LRP8的抗病毒药物和疫苗提供了关键靶点。
论文解读
研究背景：被蜱虫叮咬后的“脑内风暴”
想象一下，在森林中徒步旅行时，一只不起眼的蜱虫悄然落在皮肤上，它带来的可能不仅仅是瘙痒，还有一种名为蜱传脑炎病毒(TBEV)的致命威胁。这种病毒属于黄病毒科，主要在欧洲和亚洲流行，通过受感染蜱虫的叮咬传播给人类。一旦进入人体，TBEV便会展现出强烈的“神经嗜性”，即它偏爱攻击中枢神经系统(CNS)，引发脑膜炎、脑炎等严重神经系统并发症，重症患者甚至面临死亡风险。随着TBEV流行区域的不断扩大，其公共卫生威胁日益严峻。
尽管已有针对TBEV的疫苗，但一旦感染，临床上尚无特效的抗病毒药物。这背后的一个重要原因是，科学家们对TBEV如何进入宿主细胞、特别是如何突破血脑屏障进入大脑的分子机制知之甚少。病毒入侵是感染的第一步，而识别并利用宿主细胞表面的特定受体是病毒成功入侵的关键。长期以来，TBEV的入侵受体一直未被明确鉴定，这严重阻碍了针对病毒入侵环节开发有效治疗策略的进程。因此，寻找并验证TBEV的功能性入侵受体，成为破解其致病机制、开发新型抗病毒药物的当务之急。
关键实验技术
本研究主要采用了两种互补的筛选策略来鉴定TBEV的受体。Mittler团队利用全基因组CRISPR-Cas9敲除文库，在人类A549细胞中系统性地筛选了21,913个基因，以寻找对TBEV感染至关重要的宿主因子。Li团队则采用了靶向筛选策略，基于对低密度脂蛋白受体(LDLR)家族成员的功能推测，在K562细胞中外源表达了13种人类LDLR家族成员的配体结合域(LBDs)，以鉴定能够介导TBEV感染的候选受体。此外，研究还运用了基因敲除/过表达、蛋白质相互作用分析（如免疫共沉淀、ELISA、微量热泳动）、病毒结合与内化实验、以及体内小鼠致死性攻击模型等关键技术进行功能验证。
研究结果
1. 全基因组筛选锁定关键宿主因子LRP8
为了系统性地寻找TBEV入侵所必需的宿主因子，Mittler团队进行了一项大规模的全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选。他们利用包含21,913个基因的敲除文库，在人类A549细胞（一种人肺腺癌细胞系）中筛选能够抵抗TBEV感染的细胞。结果发现，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)的敲除，能导致TBEV报告病毒的感染性降低超过50%，并且对不同亚型的真实TBEV毒株的易感性降低了98%以上。相反，在野生型细胞中过表达LRP8，则能使TBEV报告病毒的感染性增加约2.3倍，对欧洲株和远东株TBEV的易感性分别增加超过8倍和4倍。更重要的是，在敲除细胞中重新引入LRP8表达，能够恢复TBEV的感染性。这些结果强有力地表明，LRP8是TBEV感染所必需的关键宿主因子。
2. 特异性与机制探究：LRP8与E蛋白的直接结合
为了确认LRP8作用的特异性，研究人员在13种LDLR家族同源物（包括LDLR、VLDLR、LRP1-6、LRP8、LRP10-12和LRPAP1）中进行了验证。结果显示，只有敲低或敲除LRP8才能有效抑制病毒感染，而其他家族成员则无此作用。此外，这种依赖性似乎是TBEV特有的，因为LRP8的敲除对其他测试的黄病毒，如日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒和登革热病毒，均无明显影响。
在机制上，研究人员通过免疫共沉淀、ELISA和微量热泳动等技术证实，LRP8通过其配体结合域(LBD)直接与TBEV的包膜E糖蛋白相互作用。进一步的系统截短分析发现，LA1-2是介导病毒入侵的最小功能单元，而LA1-3则保留了全部活性。病毒的结合位点则定位于E蛋白的DIII结构域。值得注意的是，这种稳定的相互作用需要通过五聚体支架(COMP)进行多价展示，以模拟病毒颗粒表面的环境，从而实现高亲和力的结合。功能上，LRP8不仅促进了病毒与宿主细胞的附着，还介导了随后通过内吞途径进行的病毒内化。
3. 靶向干预的体内外验证：诱饵蛋白的强效保护作用
基于上述发现，研究人员开发了一种可溶性的LRP8(LA1-2)-Fc诱饵蛋白，旨在通过竞争性结合病毒E蛋白来阻断其与细胞表面LRP8的相互作用。体外实验表明，这种诱饵蛋白在多种人类细胞类型（包括肝癌细胞、胶质母细胞瘤细胞和诱导多能干细胞来源的神经元培养物）中均表现出强大的抗病毒活性。
更令人振奋的是，在致死性小鼠攻击模型中的体内验证显示，该诱饵蛋白具有强大的保护作用。与对照组小鼠全部死亡相比，无论是在病毒感染前与病毒预孵育，还是在感染前6小时进行预防性给药，均能将小鼠脑内的病毒载量降低超过99.9%，显著减轻神经病理损伤，并使95%（19/20）的小鼠存活。这些结果证实，靶向LRP8-TBEV E相互作用，能够有效抑制TBEV的神经侵袭和体内致病过程。
4. 靶向筛选的独立验证：LRP8功能的广泛性与保守性
Li团队采用了另一种策略，他们基于对LDLR受体家族成员的功能推测，进行了靶向筛选。通过在K562细胞（一种对黄病毒易感性较低的红白血病细胞系）中外源表达13种选定的人类LDLR家族成员的配体结合域(LBDs)，他们同样将LRP8鉴定为TBEV的候选入侵受体，并且这种作用覆盖了该属的所有五个亚型。
与Mittler团队的研究结果一致，Li团队也独立地将LRP8的LA1-2配体结合域确定为介导与病毒E蛋白相互作用的关键区域。此外，他们的研究进一步揭示了LRP8的受体功能并不仅限于TBEV，还延伸至TBE血清复合群中的几种相关病毒，包括鄂木斯克出血热病毒(OHFV)、跳跃病病毒(LIV)、阿尔库尔马病毒(ALKV)和基萨努尔森林病病毒(KFDV)。对LRP8在其他哺乳动物物种中的同源物分析表明，其功能在不同哺乳动物宿主中是保守的，这可能有助于解释TBEV广泛的宿主范围。更重要的是，他们利用来自LRP8敲除小鼠的原代神经元培养物，在生理相关的系统中直接证明了LRP8缺失对TBEV感染的强烈抑制作用，为这一受体功能的生理重要性提供了遗传学证据。
研究结论与讨论
综上所述，这两项互补的研究共同证实，低密度脂蛋白受体相关蛋白8(LRP8)是蜱传脑炎病毒(TBEV)及相关蜱传黄病毒的功能性入侵受体。Mittler团队的全基因组筛选揭示了LRP8在LDLR家族成员中的特异性，而Li团队的靶向方法则证明了其介导TBEV亚型及相关病毒感染的能力。两项研究均聚焦于LRP8的LA1-2结构域，将其确定为病毒附着的关键界面，为理解TBEV的神经嗜性提供了机制基础，并为治疗干预奠定了坚实的基础。
值得注意的是，蜱虫是TBEV的主要储存宿主，而LRP8在人类大脑皮层中高度表达，这种分布特征与TBEV的神经嗜性高度吻合，进一步解释了病毒为何偏好攻击中枢神经系统。
尽管研究取得了突破性进展，但作者也指出了几个需要关注的局限性。首先，虽然可溶性LRP8诱饵蛋白显示出预防效果，但仍需通过条件性LRP8敲除模型的遗传学证据来确认其在自然感染中的生理作用。其次，基于LRP8策略的治疗潜力尚未得到验证，因为两项研究均未评估针对已建立的中枢神经系统感染的暴露后治疗效果。第三，LRP8-TBEV相互作用的结构基础需要通过高分辨率复合物分析来阐明，以确定关键的结合残基。最后，对蜱虫媒介和储存宿主中LRP8同源物的研究将有助于阐明病毒生态学，并为阻断传播的干预措施确定靶点。
未来，研究应致力于阐明其他LDLR家族成员是否作为其他黄病毒的受体，同时通过暴露后治疗模型和结构引导的优化，推进靶向LRP8的候选药物的研发。这些努力将决定LRP8抑制能否从一种保护性策略，发展为针对已确诊TBEV感染的治疗方案。
