尿苷通过CD45 N-糖基化增强CD8+T细胞抗肿瘤活性及其在免疫检查点抑制剂耐药中的作用机制

《Cell Metabolism》：Uridine depletion impairs CD8? T cell antitumor activity through N-glycosylation

本研究针对免疫检查D-1）治疗耐药性问题，揭示了肿瘤细胞通过SNX17-RUNX2-UPP1轴耗竭肿瘤微环境（TME）中的尿苷，进而损害CD8+T细胞功能的新机制。研究发现外源性尿苷可通过促进CD45 N-糖基化增强CD8+T细胞活性，克服高SNX17肿瘤的ICB耐药，为肿瘤免疫治疗提供了新的生物标志物和干预策略。

　　

免疫检查点阻断（ICB）疗法，特别是抗程序性死亡蛋白-1（PD-1）及其配体（PD-L1）的抗体，在癌症治疗中展现出前所未有的临床效益。然而，治疗耐药性、高昂的成本以及不明确的临床适应症显著限制了其更广泛的应用。尽管ICB能使约10%-30%的患者获得长期生存，但持续的努力仍致力于通过新策略提高其疗效。CD8⁺T细胞在肿瘤免疫监视中扮演核心角色，基于CD8⁺T细胞的免疫疗法已成为领先的治疗方法。遗憾的是，肿瘤浸润CD8⁺T细胞常常功能失调或耗竭。T细胞的功能受到效应蛋白（如干扰素-γ, IFN-γ）翻译后修饰的调控。蛋白质糖基化是一种关键的翻译后修饰，调节蛋白质构象和生理功能。在多种糖基化形式中，O-糖基化和N-糖基化与不同的细胞过程相关。N-糖基化对于淋巴细胞发育和存活至关重要。然而，T细胞中的这些修饰可能被肿瘤微环境（TME）中的代谢改变所破坏。尽管致癌信号通路导致肿瘤代谢异常，但哪些特定的代谢物影响T细胞的N-糖基化从而改变其抗肿瘤功能，目前尚不清楚。CD45是一种高度糖基化的表面蛋白，是T细胞信号传导和功能的关键调节因子。N-糖基化在调节CD8⁺T细胞中CD45功能的作用仍有待阐明。

尿苷是一种核苷，具有多种生理和代谢功能。它作为核酸合成的前体，并通过增强ATP产生支持细胞生物能量学。小鼠体内尿苷利用的减少会削弱肿瘤能量供应，最终抑制肿瘤生长。此外，尿苷通过作为活化中间体（如尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖，UDP-GlcNAc）的载体参与代谢调节，UDP-GlcNAc对于糖原和糖蛋白合成至关重要。在免疫调节方面，尿苷等核苷促进淋巴细胞分化和增殖，从而增强对病原体的抵抗力并降低细菌感染死亡率。然而，尿苷免疫调节作用的机制仍知之甚少。

在这项发表于《细胞代谢》（Cell Metabolism）的研究中，肖建彪等人利用生物信息学方法筛选出分选连接蛋白17（SNX17）这一潜在的免疫治疗耐药基因。SNX17主要调节蛋白质的内吞、分选、运输、降解和信号转导，从而维持细胞内信号稳态。研究人员发现，肿瘤组织中SNX17的高表达与患者和小鼠对抗PD-1治疗的不良反应相关。在肿瘤细胞中敲除SNX17可通过CD8⁺T细胞依赖性机制抑制肿瘤生长。机制上，SNX17通过降低TME中的尿苷浓度，抑制CD8⁺T细胞的IFN-γ产生并上调其PD-1表达。外源性尿苷在低SNX17肿瘤中显示出与抗PD-1/PD-L1相当的抗肿瘤功效，并能克服高SNX17模型中的耐药性。进一步研究发现，尿苷通过促进CD45的N-糖基化和淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）的磷酸化来增强CD8⁺T细胞功能。在分子机制上，SNX17稳定转录因子RUNX2，进而促进尿苷磷酸化酶1（UPP1）的转录，导致TME中尿苷降解。这些发现将SNX17确立为ICB反应的生物标志物，并提名尿苷作为一种经济有效的免疫治疗策略。

为开展此项研究，作者综合运用了多种关键技术方法。在模型系统上，研究使用了小鼠结直肠癌细胞系（CMT93、MC38）、肝癌细胞系（Hepa1-6）和黑色素瘤细胞系（B16F10），并在免疫健全（C57BL/6）和免疫缺陷（BALB/c nude）小鼠中建立了皮下和原位移植瘤模型。临床样本分析则基于接受抗PD-1抗体治疗的结直肠癌（CRC）患者队列（n=44）和公共基因表达数据集（如TCGA）。基因操作主要依赖CRISPR-Cas9技术敲除（如SNX17、UPP1、RUNX2）或利用慢病毒载体过表达目标基因。细胞功能评估采用了体外T细胞活化与共培养、细胞毒性试验以及酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子（如IFN-γ）。代谢组学分析通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测尿苷等代谢物水平。免疫应答分析则借助流式细胞术（FACS）检测肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）亚群和功能状态，以及单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析免疫微环境。分子机制探索采用了蛋白质印迹（Western Blot）、免疫共沉淀（Co-IP）、染色质免疫共沉淀（ChIP）以及糖基化分析（如MAL II凝集素染色）等技术。

研究成果

SNX17在肿瘤组织中高表达与免疫治疗不良反应相关

研究人员通过分析公共基因表达数据集，发现SNX17是高SNX17表达与CD8⁺T细胞浸润呈负相关。在接受抗PD-1治疗的CRC患者临床队列中，疾病进展（PD）组肿瘤组织的SNX17表达显著高于部分缓解（PR）或疾病稳定（SD）组。在动物模型中，过表达SNX17的CMT93肿瘤对抗PD-1治疗不敏感。

SNX17在肿瘤中抑制抗肿瘤免疫

利用CRISPR-Cas9技术敲除CMT93细胞中的SNX17后，其在体外的增殖能力未受影响，在免疫缺陷的BALB/c nude小鼠中的肿瘤生长也无差异，但在免疫健全的C57BL/6小鼠中，SNX17缺失显著抑制了肿瘤进展。类似的结果也在MC38、Hepa1-6和B16F10细胞系中得到验证。相反，过表达SNX17则增强了CMT93细胞在C57BL/6小鼠中的皮下肿瘤生长。这些结果表明SNX17是一种新型的抗肿瘤免疫抑制因子。

SNX17通过CD8⁺T细胞限制抗肿瘤免疫

对来自皮下CMT93肿瘤的CD45⁺细胞进行scRNA-seq分析显示，SNX17敲除肿瘤中CD4⁺和CD8⁺T细胞的比例升高，而粒细胞比例下降。基因集富集分析（GSEA）表明，SNX17缺失显著富集了T细胞分化和活化相关通路，效应功能增强，耗竭标志物降低。流式细胞术进一步证实，SNX17缺陷肿瘤中瘤内CD4⁺和CD8⁺T细胞的比例和绝对数量均显著增加。通过体内抗体清除实验发现，清除CD8⁺T细胞（而非CD4⁺T细胞）可逆转SNX17缺失导致的肿瘤生长抑制。这表明SNX17通过依赖CD8⁺T细胞活性的机制抑制肿瘤免疫应答。

SNX17通过促进尿苷消耗来调节CD8⁺T细胞活性

研究发现，SNX17缺陷肿瘤细胞的培养上清液能显著促进CD8⁺T细胞产生IFN-γ，且该效应可耐受煮沸或小分子量过滤，提示小分子代谢物是活性成分。质谱分析显示，SNX17缺陷细胞培养上清液中核苷和脂质代谢物增加，其中尿苷的刺激作用最强。SNX17缺失导致细胞内外及肿瘤组织中的尿苷水平显著升高，而过表达SNX17则降低尿苷水平。共培养实验表明，肿瘤细胞与CD8⁺T细胞竞争摄取尿苷。外源性尿苷以剂量依赖的方式增强小鼠和人CD8⁺T细胞的IFN-γ产生。使用尿苷摄取抑制剂NBTI或敲除主要尿苷转运体SLC29A1，均能废除尿苷对CD8⁺T细胞的激活作用。

尿苷增强CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫

体内实验表明，腹腔注射或饮食补充尿苷能显著抑制免疫健全小鼠中CMT93和B16F10肿瘤的生长，但在免疫缺陷鼠中无效。清除CD8⁺T细胞可废除尿苷的抗肿瘤效果。从尿苷治疗小鼠肿瘤中分离的CD8⁺T细胞表现出更高的IFN-γ产生和更低的PD1表达。尿苷单药治疗延迟肿瘤生长的效果与抗PD-1或抗PD-L1单药治疗相当，并且在SNX17过表达的CMT93肿瘤中，尿苷与抗PD-1抗体联用显示出协同抑瘤效果。

尿苷通过增强CD45的N-糖基化促进CD8⁺T细胞活性

机制探索表明，尿苷通过其代谢产物UTP促进UDP-GlcNAc的合成。尿苷处理显著提高了CD8⁺T细胞内的UDP-GlcNAc水平。使用N-糖基化抑制剂衣霉素（TM）可抑制尿苷诱导的IFN-γ表达增强，而O-糖基化抑制剂或内质网应激诱导剂则无此效果。凝集素染色和质谱分析发现，尿苷处理增强了CD8⁺T细胞中蛋白质的N-糖基化水平，其中CD45是显著上调的糖蛋白之一。免疫共沉淀证实尿苷增强了CD45的N-糖基化。敲除UDP-糖基转移酶或使用CD45缺陷的T细胞实验表明，尿苷的作用依赖于CD45的N-糖基化。进一步研究发现，尿苷通过促进CD45的N-糖基化，增强了LCK及其下游信号蛋白ZAP70和CD3ζ的磷酸化。使用LCK磷酸化抑制剂PP2可逆转尿苷诱导的IFN-γ产生。

SNX17通过UPP1降低尿苷水平

RNA-seq分析发现，UPP1是SNX17调控的下游关键差异表达基因。SNX17敲除降低，而过表达则升高UPP1的mRNA和蛋白水平。临床数据分析显示，UPP1高表达与CRC患者抗PD-1治疗耐药和不良预后相关。UPP1敲除模拟了SNX17敲除的表型，导致肿瘤内尿苷水平升高、CD8⁺T细胞IFN-γ产生增加和肿瘤生长抑制。在UPP1缺陷细胞中过表达SNX17不能改变尿苷水平，而在SNX17缺陷细胞中过表达UPP1则可恢复尿苷消耗并逆转抗肿瘤免疫表型。

SNX17通过RUNX2上调UPP1表达

机制上，染色质免疫共沉淀（ChIP）证实RUNX2结合UPP1启动子。SNX17与RUNX2蛋白存在相互作用，并能稳定RUNX2蛋白，防止其溶酶体降解。RUNX2敲除抑制肿瘤生长，且RUNX2高表达与抗PD-1治疗耐药和预后不良相关。在SNX17过表达细胞中敲除RUNX2，可恢复UPP1表达、增强CD8⁺T细胞功能并抑制肿瘤生长。这表明SNX17通过稳定RUNX2转录因子来促进UPP1转录，进而消耗TME中的尿苷。

研究结论与意义

该研究揭示了一条全新的代谢-免疫调控轴：肿瘤细胞通过SNX17-RUNX2-UPP1信号通路加速尿苷分解代谢，导致TME中尿苷耗竭，进而通过削弱CD8⁺T细胞关键信号蛋白CD45的N-糖基化，抑制其磷酸化级联反应和效应功能（如IFN-γ产生），最终导致抗肿瘤免疫失效和ICB耐药。研究不仅首次阐明了尿苷-CD45 N-糖基化在调节CD8⁺T细胞功能中的核心作用，还发现了SNX17和UPP1作为预测ICB疗效的潜在生物标志物。更重要的是，研究提出外源性补充尿苷是一种能够增强T细胞功能、克服ICB耐药性的有前景的免疫治疗策略，为肿瘤免疫治疗提供了新的思路和靶点。这些发现深化了对肿瘤免疫代谢微环境的理解，具有重要的理论价值和临床转化潜力。