《Antioxidants》：Ultrasound-Assisted Extraction of Bioactive Compounds from Strawberry Pomace: Optimization and Bioactivity Assessment
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本文系统研究了超声辅助提取（UAE）技术对草莓果渣中生物活性化合物的优化提取工艺，并利用人工神经网络（ANN）模型进行精准预测。研究证实UAE是一种高效、环保的提取方法（AGREEprep评分0.68/1），在优化条件（20分钟，50°C，料液比1:20 g/mL）下获得的提取物具有最高的总酚（16.49 mg GAE/g）和总黄酮（2.10 mg RE/g）含量，并展现出强大的抗氧化活性（DPPH， ABTS， CUPRAC， FRAP）和显著的酶抑制能力（尤其对酪氨酸酶抑制达55.45 mg KAE/g）。该研究为草莓加工副产物的高值化利用（食品、保健品、制药）提供了绿色、高效的解决方案。
超声辅助提取草莓果渣生物活性化合物：优化与生物活性评估
引言
全球废弃物价值化市场正在迅速扩张，水果加工业产生了大量有机副产物。草莓（Fragaria × ananassa）果渣是果汁和果泥生产过程中的主要残留物，富含多酚、黄酮类化合物和其他次级代谢产物，具有抗氧化、抗炎和酶抑制等作用。超声辅助提取（UAE）作为一种绿色、快速、高效的提取方法，通过声空化效应增强传质、破坏植物细胞壁并改善溶剂渗透性，从而在减少处理时间、能耗和溶剂用量的同时，最大化生物活性化合物的回收。本研究旨在系统研究通过UAE对草莓果渣进行价值化，并利用人工神经网络（ANN）进行建模和优化，全面表征提取物的总酚和总黄酮含量、抗氧化能力以及对关键酶的抑制活性，为草莓果渣作为高价值功能性成分在食品、营养保健品和药物制剂中的应用提供基础。
材料与方法
研究所用草莓果渣由塞尔维亚的Nectar d.o.o.公司提供。果渣经过冷冻后在-30°C下储存24小时，然后进行冷冻干燥（压力1.6 Pa，冷凝器温度-57°C，过程持续48小时）。干燥后的样品被研磨成均匀粒径的粉末。
超声辅助提取（UAE）使用固定频率为45 kHz的超声波清洗槽进行。将一定质量的冻干草莓果渣转移到150 mL锥形瓶中，加入指定量的水，并置于超声波清洗槽中。优化了提取时间、温度和料液比等实验参数。提取后，粗提物通过Whatman?滤纸过滤并收集在玻璃瓶中。每个实验重复三次，提取物在4°C下保存直至分析。
使用AGREEprep指标评估样品制备方法（冻干和提取）的环境影响，总得分为0.68/1，表明该方法对环境友好。红色区域归因于样品制备是异位进行以及冻干步骤能耗较高。
总酚含量（TPC）采用Folin-Ciocalteu法测定，总黄酮含量（TFC）采用氯化铝比色法测定。抗氧化能力通过DPPH、ABTS、CUPRAC、FRAP、金属螯合（MC）和总抗氧化活性（PM）等体外实验进行评估。酶抑制活性针对乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BChE）、酪氨酸酶、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶进行测定。
统计评估使用StatSoft Statistica 10.0?软件进行。采用具有强大非线性函数逼近能力的人工神经网络（ANN）模型，使用多层感知器（MLP）架构开发。在构建ANN模型之前，对输入和输出数据集进行归一化以提高预测效率。网络训练遵循研究报告的方法。为确保小数据集（N = 15）下的稳健验证，将观察结果分为训练集（60%）、测试集（20%）和验证集（20%），并计算了100,000个模型以找到最优模型结构。
结果
总酚和总黄酮含量
草莓果渣提取物的总酚含量（TPC）范围在8.69至16.49 mg GAE/g之间，总黄酮含量（TFC）在0.80至2.10 mg RE/g之间。6号样品（提取时间20分钟，温度50°C，料液比1:20 g/mL）显示出最高的TPC和TFC值，表明中等提取时间、适中温度和较高溶剂体积共同确保了酚类和黄酮类化合物的最佳回收率。相反，在较短时间和/或较低溶剂体积下提取的7号和14号样品表现出最低的TPC和TFC，表明这些条件限制了生物活性化合物的提取效率。在较高温度（75°C）下获得的提取物中观察到较低的TPC值，可能表明温度对酚类化合物稳定性和回收率的影响。
草莓果渣提取物的抗氧化活性
使用六种互补实验（DPPH、ABTS、CUPRAC、FRAP、金属螯合和磷钼酸盐法）评估了草莓果渣提取物在不同UAE条件下的抗氧化能力，全面评估了其自由基清除和还原潜力。6号样品在所有实验中均显示出最高的活性：DPPH 32.70 mg TE/g，ABTS 46.76 mg TE/g，CUPRAC 57.29 mg TE/g，FRAP 38.90 mg TE/g，MC 19.14 mg EDTAE/g，PM 0.54 mmol TE/g。这些趋势与观察到的总酚（TPC）和总黄酮（TFC）含量密切相关，证实了酚类和黄酮类化合物是草莓果渣提取物抗氧化能力的主要贡献者。草莓果渣中含有的其他生物活性成分，如有机酸、花青素、鞣花单宁和纤维相关多糖，可能通过叠加或协同效应进一步促进观察到的抗氧化活性。
草莓果渣提取物的酶抑制活性
提取物针对与神经退行性疾病（乙酰胆碱酯酶[AChE]、丁酰胆碱酯酶[BChE]）、色素沉着过度（酪氨酸酶）和碳水化合物代谢（α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶）相关的关键酶进行了评估。观察到样品间存在显著变异性，表明提取参数对负责酶抑制的生物活性化合物回收率有强烈影响。值得注意的是，最高的AChE抑制活性在3号样品中观察到（2.54 mg GALAE/g），而最高的BChE抑制则在7号样品中检测到（2.36 mg GALAE/g）。酪氨酸酶抑制在6号样品中达到峰值（55.45 mg KAE/g）。相比之下，α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性普遍中等，α-淀粉酶抑制最大值在11号样品（0.902 mmol ACAE/g），α-葡萄糖苷酶抑制再次在3号样品中最高（1.114 mmol ACAE/g）。这些结果表明，针对TPC、TFC和抗氧化活性优化的UAE条件（样品6）并不与所有酶抑制活性的最佳条件重合，强调每个酶促反应都受到特定植物化学成分的影响。
相关性分析显示，TPC、TFC和抗氧化实验（DPPH、ABTS、CUPRAC、FRAP）之间存在强正相关关系，所有相关系数均超过0.83。FRAP和CUPRAC之间（r = 0.9730）以及DPPH和FRAP之间（r = 0.9572）观察到最强的相关性。抗氧化参数与酶抑制活性（AChE、BChE、酪氨酸酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶）之间观察到弱或不显著的相关性。这些结果表明抗氧化能力主要由存在的酚类和黄酮类化合物的量决定，而这些化合物在酶抑制中似乎没有发挥一致或主导作用。其他植物化学类别，包括萜类、生物碱、皂苷和次要次级代谢产物，可能对抑制活性有显著贡献。
主成分分析（PCA）和聚类分析（HCA）
对所得结果的主成分分析（PCA）揭示了两个主成分，解释了总方差的61.81%。PC1解释了46.15%的方差，主要与抗氧化能力和酚类含量相关。PC2解释了15.66%的方差，其特征是酶抑制活性（特别是BChE和AChE）以及PM实验的高负载荷。PCA双标图清晰地区分了这两个功能域：抗氧化相关变量聚集在一起，指向与酶抑制变量相反的方向。这种分离突出了提取物不同的生化特征，并表明抗氧化和酶抑制效应由不同的植物化学物质组控制。
层次聚类分析（HCA）使用完全连接和City-block（曼哈顿）距离进行，揭示了反映其生物活性谱相似性的三个主要聚类。聚类I包括样品1、2、4、5、13和14，在低连接距离下显示出高度相似性。聚类II包括样品3、7、8、9、10、11、12和15，表现出中等的簇内相似性。聚类III仅由样品6组成，它在高连接距离（>100）处与所有其他样品分离，表明其独特的生化特征。
人工神经网络（ANN）建模与优化
开发了人工神经网络（ANN）来模拟观察到的响应，包括TPC、TFC、抗氧化实验（DPPH、ABTS、CUPRAC、FRAP、MC、PM）和酶抑制活性（AChE、BChE、酪氨酸酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶）。构建了三个独立的ANN模型（ANN1、ANN2、ANN3）。隐藏层中最优神经元数量确定为9、10和10，分别对应网络结构MLP 3-9-2、MLP 3-10-6和MLP 8-6-1/3-10-5。所开发的模型表现出优异的预测性能，在训练阶段的确定系数（r2）分别达到0.999、0.999和0.999，在测试阶段分别为0.997、0.996和0.999，证实了模型的有效性和稳健性。
使用标准分数分析对ANN优化进行验证，其中计算所有测量响应的平均Z分数。6号样品获得了最高的综合Z分数0.794，确认其为最佳条件。该提取物代表了抗氧化和酶抑制活性之间的最佳折衷，支持了基于ANN的优化在指导工艺参数方面的有效性。
ANN模型优化和标准分数分析确定6号样品为最佳提取物。该样品使用20分钟UAE在50°C下，料液比为1:20 g/mL获得。该最佳草莓果渣提取物的测量值如下：总酚16.494 ± 0.149 mg GAE/g，总黄酮2.103 ± 0.006 mg RE/g，DPPH 32.695 ± 0.568 mg TE/g，ABTS 46.764 ± 0.315 mg TE/g，CUPRAC 57.285 ± 1.619 mg TE/g，FRAP 38.900 ± 1.298 mg TE/g，MC 19.140 ± 0.148 mg EDTAE/g，PM 0.542 ± 0.032 mmol TE/g，AChE 2.320 ± 0.019 mg GALAE/g，BChE 2.058 ± 0.016 mg GALAE/g，酪氨酸酶55.453 ± 0.201 mg KAE/g，α-淀粉酶0.738 ± 0.019 mmol ACAE/g，α-葡萄糖苷酶0.965 ± 0.085 mmol ACAE/g。
结论
超声辅助提取（UAE）被证明是草莓果渣价值化的一种高效且可持续的方法，可产生富含生物活性化合物的提取物。虽然观察到总酚含量与抗氧化潜力之间存在强正相关，但酶抑制活性与总酚的关系更为复杂且不那么直接。相反，这些活性受到不同植物化学组分的影响，可能包括萜类、生物碱、皂苷和其他次要次级代谢产物。这种差异突出了提取物组成的复杂性，并清楚地表明总酚不足以预测多功能酶抑制效应。多变量统计分析和人工神经网络（ANN）建模进一步证实了将先进预测工具与UAE相结合的有效性，确定了平衡抗氧化和酶抑制活性的最佳提取条件（50°C下20分钟，植物与溶剂比例1:20 g/mL）。这些发现不仅强化了UAE在获取富含酚类的抗氧化组分方面的价值，而且揭示了非酚类化合物对酶抑制的显著且先前未被充分探索的贡献，这代表了对农业食品副产物功能价值化的新颖见解。
未来的研究将侧重于使用先进的色谱技术对提取物进行详细的色谱表征，以能够识别和定量测定负责酶抑制的单个生物活性化合物。此类分析将通过将特定的分子特征和色谱峰与不同的功能域（抗氧化活性与酶抑制）直接联系起来，从而验证优化模型。此外，化合物水平表征将显著增强UAE工艺的可重复性、应用价值和可扩展性，从而为生物利用度评估以及食品、营养保健品和药物制剂的开发提供坚实的基础。
