《Antioxidants》：From Reshaped Metabolome to Repaired Skin: Fermented Gastrodia elata Alleviates UVB-Induced Damage Through Controlled Immune Activation
摘要
紫外线B（UVB，280–320 nm）是导致皮肤光损伤、炎症反应和加速皮肤老化的主要外源性风险因素。UVB可直接损伤DNA并诱导活性氧（ROS）过量产生，导致脂质过氧化、胶原降解和皮肤屏障破坏。在应激早期，机体迅速激活炎症反应，释放促炎细胞因子以启动组织保护性反应。然而，过度或持续的炎症反应会阻碍愈合过程并导致慢性组织损伤。
天然药物因其高安全性和多靶点调控特性，在组织损伤修复方面显示出巨大潜力。天麻（Gastrodia elata）是一种药食同源植物，具有抗氧化、抗炎和神经保护特性。但其主要活性成分（如天麻素和多糖）的生物利用度较低，限制了其药用功效。唾液乳酸杆菌（Lactobacillus salivarius）是一种广泛用于肠道免疫调节的益生菌菌株，可通过调节机体免疫防御能力和NF-κB炎症通路实现组织保护。
微生物发酵是一种具有悠久历史的生物加工方法，广泛应用于制药、食品加工和农业。研究证实，微生物发酵作为一种生物转化过程，可有效改变中药和食品植物的生物活性，从而产生新的治疗作用，包括对肠道微生物群组成和免疫系统的有益影响。
近期研究发现，微生物发酵的天麻具有抗抑郁和抗失眠作用。此外，研究结果还表明，发酵天麻可减少凋亡细胞数量，并调节参与神经元分化和DNA修复的各种基因的表达水平。
然而，目前尚无关于乳酸杆菌发酵天麻缓解UVB诱导皮肤损伤能力的报道。此外，初步实验结果表明，除了具有抗氧化潜力外，GL还能通过重塑炎症信号网络、平衡免疫和修复过程来缓解皮肤炎症并促进组织修复。鉴于这些考虑，可以合理假设GL有潜力成为一种皮肤抗炎和修复剂。
本研究旨在探讨GL是否能缓解UVB诱导的皮肤损伤。为验证此效果，我们系统整合了小鼠皮肤中的氧化应激标志物、抗氧化酶、炎症因子、组织病理学（H&E和Masson染色）、凋亡染色（TUNEL）和皮肤转录组分析，以探索GL触发的必要调控过程。
材料与方法
菌株来源
唾液乳酸杆菌AACE1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No. 20700。
唾液乳酸杆菌AACE1发酵天麻
新鲜天麻于2024年采集自云南省昭通市小草坝镇的种植基地。将新鲜天麻洗净切块，按天麻块茎与无菌水1:4（w/w）的比例混合。混合物在匀浆机中以20,000 rpm处理7分钟，获得均匀悬浮液。悬浮液经巴氏消毒（60°C灭菌30分钟），冷却至室温后，在无菌条件下以1.0 × 108CFU/mL的浓度接种唾液乳酸杆菌AACE1，接种比例为1:20（w/w）。混合物在37°C的密闭容器中培养7天。发酵终止后，混合物在60°C灭菌30分钟。冷却至室温后，以4000 rpm离心5分钟去除残渣。最后，将产物包装并用液氮淬灭，获得最终的GL产品。
动物与治疗
5周龄C57BL/6J小鼠由北京某生物技术有限公司提供SPF级动物。小鼠饲养条件如下：温度（22 ± 2°C）、光照（12小时光/暗循环）、湿度（50–60%）、自由摄食饮水。所有实验程序均经昆明理工大学实验动物伦理委员会批准。经过1周适应期后，小鼠随机分为六组。所有实验组每天在剃毛的背部UVB照射区域均匀涂抹相应制剂（0.2 mL），并轻轻按摩以确保吸收。在涂抹期间，单独饲养和观察有效防止了小鼠相互舔舐。分别于第5天和第18天处死每组中的三只小鼠，收集背部皮肤组织。组织样本立即在液氮中冷冻，并储存于-80°C用于后续分析。UVB照射模型基于先前研究建立：使用两个15 W UVB灯（峰值波长：313 nm），在照射平面提供校准后的辐照度为1.5 mW/cm2。连续照射三天，每日照射时间分别为50、50和43.3秒，累计剂量不超过430 mJ/cm2。
根据疾病活动指数（DAI）评分标准，15名未参与本试验的研究人员系统评估并记录了小鼠背部的每日宏观临床表现，以确保结果的客观性。
酶联免疫吸附测定
使用商业化的ELISA试剂盒测定皮肤组织中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、髓过氧化物酶（MPO）、TGF-β、IL-10、IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度。
组织化学
收集的皮肤组织用4%缓冲甲醛固定，石蜡包埋，进行苏木精-伊红（H&E）、Masson三色和TUNEL染色，然后在显微镜下观察。使用扫描仪进行图像采集。H&E和Masson染色后的数字切片使用CaseViewer软件分析，TUNEL染色使用Saiviewer软件进行图像分析。
GL内毒素浓度
使用商业化的鲎试剂（LAL）检测试剂盒（快速凝胶法）定量样品中的内毒素水平。简要步骤如下：将0.5 mL制备好的GL产品移入样品测试管（SPL管）。将0.25 mL SPL溶液移入阳性产品对照管（PPC管）。轻轻混合两个试管，并在干浴培养箱中于37°C孵育21分钟。结果判读：仅当PPC管在180°反转时形成牢固、不滑动的凝胶（+），试验才有效。对于有效试验，如果SPL管未形成凝胶或形成不完整、滑动的凝胶（–），则内毒素浓度记录为<0.25 EU/mL；如果SPL管形成牢固、稳定的凝胶（+），则记录为≥0.25 EU/mL。
天麻代谢组学
本研究采用整合色谱和质谱的非靶向代谢组学方法研究发酵天麻的代谢变化。样品制备过程详见补充材料。简要而言，使用预冷的甲醇/乙腈/水溶液（2:2:1，v/v/v，含5 ppm L-2-氯苯丙氨酸作为内标）提取植物样品。提取过程包括组织匀浆、超声、低温沉淀和高速离心。上清液在真空下浓缩至干。将干燥的代谢物复溶，通过0.22 μm膜过滤，准备进行LC-MS分析。
色谱分离使用维持在40°C的ACQUITY UPLC HSS T3柱实现。流动相由0.1%甲酸水溶液（A相）和0.1%甲酸乙腈溶液（B相）组成，洗脱梯度程序详见补充材料。质谱分析在Thermo Orbitrap Exploris 120质谱仪上进行，采用正/负离子切换模式和数据依赖性采集（DDA），以确保全面覆盖代谢物谱。
使用Compound Discoverer? 3.3软件处理原始数据，进行峰检测、对齐、归一化和缺失值插补。通过搜索公共数据库（包括mzCloud、HMDB和Lipid MAPS）进行代谢物鉴定。通过整合多变量统计分析和单变量检验（Student t检验、倍数变化）识别实验组间的差异表达代谢物，随后进行KEGG通路富集分析以阐明其生物学意义。本研究生成的数据已保存于国家基因组科学数据中心，可自由获取。
小鼠皮肤转录组
使用Trizol试剂从小鼠皮肤中提取总RNA，使用Nanodrop检测浓度和纯度，使用Agilent 2100检测完整性。选择≥1 μg RNA，使用NEBNext Ultra II链特异性文库构建试剂盒构建文库。通过磁珠富集mRNA，打断，合成cDNA，末端修复，连接接头，筛选片段，并进行PCR扩增。使用Agilent 2100和PicoGreen测定文库的质量和浓度，经qPCR定量后等量混合。最后使用Illumina平台PE150模式对文库进行测序。本研究生成的序列已存入NCBI，可在登录号SUB15637225下获取。
差异基因表达与功能富集分析
使用DESeq2进行差异基因表达分析。主成分分析（PCA）、相关性分析热图、火山图和维恩图均使用免费的在线平台Personalbio GenesCloud创建。显著通路因子图和差异基因热图使用在线绘图平台绘制，使用ChiPlot绘制显著代谢物与理化因子相关性热图。
统计分析
使用IBM SPSS Statistics进行数据分析。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性。使用Levene检验确认方差齐性。使用单因素方差分析和Tukey事后检验进行多组比较。使用GraphPad Prism 8创建线图、柱状图和小提琴图。显著性阈值设定为p < 0.05。
结果
GL缓解UVB诱导的小鼠急性皮肤损伤
小鼠宏观结果显示，所有实验组在UVB照射后均表现出急性光损伤特征，包括皮肤增厚、起皱、红斑和水肿。皮肤损伤程度在照射后第4至第6天达到峰值，相应的DAI评分最高。第10天，GL组的恢复情况与VE组相似，且优于GB组和M组。至第18天，GL组和VE组的皮肤损伤已消失，而M、GB和LS组仍存在明显损伤。总体而言，随着时间的推移，各组皮肤状况逐渐改善，GL和VE处理显著促进了UVB诱导的皮肤损伤的修复。
皮肤组织学分析结果显示，在实验第5天，H&E和Masson染色显示，除CK组外，其他组均呈现典型的皮肤损伤和修复早期特征，包括表皮结构不完整、真皮坏死、炎性细胞浸润以及肉芽组织中胶原纤维疏松、不规则和染色浅。至第18天，两种染色结果揭示了各组修复效果的显著分化：M、GB和LS组恢复不完全，仍分别存在角化过度、异常增生和持续炎性浸润等病理现象。尽管胶原纤维有少量到大量增殖，但大多纤细不成熟；相比之下，GL组和VE组显示出最佳的综合修复效果。皮肤表皮结构完整，细胞形态和排列恢复正常，真皮结构均匀。此外，GL组表现出突出的胶原修复效果，在其真皮层观察到大量排列规则、接近正常水平的成熟胶原纤维，整体效果优于VE组。
此外，我们在第18天对小鼠皮肤进行了TUNEL染色。综合TUNEL染色结果、平均光密度值图以及不同组别处理后的皮肤外观，结果显示：M组凋亡率为35.02%，表观修复状态差；GB组凋亡率为15.49%，表观修复仍较差；LS组凋亡率仅为0.54%，但表观修复滞后；而GL组在保持低凋亡率（1.36%）的同时，表观修复良好。
GL在缓解氧化应激和炎症方面的优势表现
随着实验进程的推进，UVB处理小鼠的皮肤抗氧化因子（GSH和SOD）总体呈下降趋势。氧化损伤标志物MDA水平下降，促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α和MPO）减少，抗炎因子（TGF-β和IL-10）增加。M组在第5天和第18天均处于氧化应激和炎症反应状态，其GSH、SOD、TGF-β和IL-10水平显著低于CK组，而IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA和MPO水平显著升高。
在第5天，GL组表现出最突出的抗氧化和抗炎效果。在氧化指标方面，GL组和GB组的GSH和SOD水平显著高于M、LS和VE组，且接近CK组水平。GL组的MDA水平显著低于其他UVB处理组。在炎症因子方面，GL组和GB组的IL-1β和TNF-α水平无显著差异，但显著低于M组。GL组的IL-6和MPO水平是所有处理组中最低的，显著低于其他组，且最接近CK组。GL组和GB组的IL-10水平相似，但低于VE组和CK组。GL组的TGF-β水平显著高于其他处理组，且最接近CK组。这些结果表明，在炎症高峰期（第5天），GL组有效缓解了氧化应激和炎症损伤。
在第18天，GL组的恢复效果更为显著。在氧化指标方面，GL组的GSH水平仍与GB组一致。SOD水平显著高于CK组和其他处理组。GL组的MDA水平与VE组相似，仅略高于CK组。在炎症方面，GL组的IL-6、TGF-β和MPO水平恢复至与CK组相同水平，且显著低于其他处理组。IL-1β水平与VE组相似，是所有组中最接近CK组的。IL-10水平仅次于VE组和CK组；TGF-β水平已达到VE组和CK组的水平，无显著差异。
内毒素检测结果
内毒素检测结果显示PPC为阳性，SPL为阴性，样品中内毒素浓度低于0.25 EU/mL。
发酵条件与代谢组学
在7天的发酵过程中，接种的唾液乳酸杆菌AACE1快速生长、繁殖并代谢产酸，导致天麻的pH值从初始的5.42迅速降至3.01。相应地，活菌数在第二天达到峰值（2 × 109CFU/mL）后，由于乳酸积累和低pH环境下的自我抑制，持续下降至5.32 × 106CFU/mL。
对差异代谢物进行KEGG通路富集分析发现，发酵天麻的代谢变化显著富集于几个与其生物活性密切相关的通路。这些通路主要集中于氨基酸的生物合成与代谢（如丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢）、谷胱甘肽代谢和β-丙氨酸代谢。值得注意的是，谷胱甘肽代谢是关键的细胞内抗氧化通路，而精氨酸、脯氨酸等氨基酸的代谢直接参与皮肤组织修复和免疫调节。此外，D-氨基酸代谢和精氨酸生物合成等通路提示发酵产物可能具有抗菌和抗炎活性。这些结果表明，发酵重塑了天麻的代谢谱，显著增强了其潜在的抗氧化、抗炎、抗菌活性以及促进皮肤修复的能力。
基于|log2FoldChange|筛选前20个差异代谢物发现，经唾液乳酸杆菌AACE1发酵后，天麻中多种关键生物活性物质的水平显著增加，这些物质在皮肤修复中具有明确的功能潜力。其中，Nigrolineaxanthone N和Obtusifolin是有前景的活性分子，据报道具有显著的抗菌和抗炎特性，有助于维持皮肤微生态平衡，为修复创造有利环境。同时，发酵显著促进了各种功能性氨基酸衍生物的生成。例如，与胶原合成密切相关的Gly-Hyp，以及容易跨越生物膜并被认为具有潜在皮肤渗透性的小环二肽cyclo(phenylalanyl-prolyl)。此外，发酵特异性富集了以其天然抗菌特性而闻名的D(+)-Phenyllactic acid。同时，Sculponeatin D是一种enmein衍生的ent-kaurane二萜类化合物，enmein对革兰氏阳性菌的抗菌活性表明Sculponeatin D可能发挥类似的抗菌作用。可透皮吸收的Glycine和Daidzein可减少角质形成细胞凋亡，并具有抗氧化和抗炎作用。值得注意的是，吡哆胺是维生素B6的一种形式，在蛋白质代谢和维持皮肤健康方面起关键作用。总之，这些结果证明发酵处理可以有效、定向地增强天麻促进胶原生成、发挥抗菌抗炎作用和维持皮肤屏障的潜力。
根据相关性分析结果，促炎细胞因子IL-6与目标差异代谢物呈显著负相关，氧化损伤标志物MDA也与这些代谢物呈显著负相关。同时，抗氧化酶SOD和免疫调节因子TGF-β与目标代谢物组呈显著正相关。这些结果表明，涉及的差异代谢物可能共同参与抑制炎症反应、减少氧化损伤、增强机体抗氧化能力和免疫调节功能。
GL介导的基因调控
为揭示GL修复UVB诱导皮肤损伤的分子机制，我们对小鼠背部皮肤组织进行了转录组分析。基因表达相关性分析表明实验数据稳定，样本分组合理。主成分分析进一步揭示了组间明显的分离，表明它们的转录水平存在显著差异。
为了分析基因表达的变化，我们进行了差异基因表达分析并统计了基因数量。在第5天，通过皮肤转录组分析鉴定出5077个差异表达基因。与CK组相比，M组有3192个基因上调和1885个基因下调。与M组相比，GL组有466个基因上调和255个基因下调；LS组有262个基因上调和522个基因下调；GB组有380个基因上调和353个基因下调。维恩分析显示，有84个基因在CK组与M组比较以及M组与LS、GB、GL组比较中均被显著调控。
至第18天，鉴定出1724个差异表达基因。与CK组相比，M组有1467个基因上调和257个基因下调。与M组相比，GL组有295个基因上调和321个基因下调；LS组有66个基因上调和183个基因下调；GB组有98个基因上调和178个基因下调。维恩分析显示，有38个基因在CK组与M组比较以及M组与LS、GB、GL组比较中均被显著调控。这38个重叠DEGs的热图显示，天麻和发酵天麻逆转了UVB皮肤损伤的调控，并使基因表达模式更接近CK组。根据各组DEGs数量的不同，我们发现GL组的调控范围在第5天与GB组和LS组相当，而在第18天显著高于其他UVB处理组。结果表明，GL组在转录组水平的调控效果不仅优于GB和LS，而且在恢复阶段更接近正常状态。
小鼠皮肤差异基因KEGG信号通路
由于实验组在第5天皮肤炎症反应最显著且差异表达基因数量最多，我们重点分析了此时LS、GB和GL组在炎症反应中的不同调控机制。KEGG富集分析显示，与M组相比，三个处理组的炎症-免疫相关通路均有不同程度富集，其中细胞因子-细胞因子受体相互作用（CK-CKR）通路是三个组共同上调的通路。该通路中的差异表达基因主要包括属于CXC亚家族的Cxcl1/2/3/9/10、属于CC亚家族的Ccl2/3/4/12、各种细胞因子如Il1a、Il1b、Il12b、Il27和Osm，以及属于TNF家族的TNF、Fas和Ltb。同时，GL组在该通路中显示出最强的富集程度，表明其对炎症反应的调控特征更强。
在此基础上，模式识别受体（PRR）介导的先天免疫通路显著上调，包括Toll样受体信号通路（TLR，包括Tlr2、Cd14、Cd80、Il12a/12b等基因）和NOD样受体信号通路（NLR，包括Gbp2/3/5、Nlrp3、Irf7、Casp4、Mefv、Oas1a/1g/3、Ifi204等基因）。值得注意的是，NLR通路仅在GL组中显著富集，表明GL组不仅增强了对病原体相关分子模式（PAMPs）的识别，还特异性增强了对损伤相关分子模式（DAMPs）的感知，从而共同激活炎症小体的形成
