《Antioxidants》：Apigenin Alleviates Zearalenone-Induced Oxidative Stress and Apoptosis in Swine Testis Cells Through the Wnt Signaling Pathway
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本研究揭示了芹菜素（AP）通过上调低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）表达，激活Wnt信号通路，从而有效缓解玉米赤霉烯酮（ZEN）诱导的猪睾丸（ST）细胞氧化应激、细胞周期阻滞及凋亡。该发现为AP作为饲料添加剂预防ZEN生殖毒性提供了分子理论依据。
1. 引言
玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）是一种主要由镰刀菌产生的非甾体雌激素类真菌毒素，广泛存在于玉米、小麦等谷物及其加工副产品中。ZEN因其结构与内源性雌激素相似，能干扰正常的雌激素稳态，对生殖系统造成严重损害。在雄性动物中，ZEN可导致睾丸功能受损、精子质量下降、生精细胞凋亡，从而引发多种生殖系统疾病。因此，开发有效的策略来缓解ZEN的生殖毒性，已成为饲料和食品安全领域的研究重点。
芹菜素（Apigenin, AP）是一种广泛存在于芹菜、洋甘菊、洋葱等果蔬中的天然黄酮类化合物，具有植物雌激素特性，并表现出抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌等多种药理活性。已有研究表明，AP对多柔比星和丙烯腈等物质诱导的睾丸损伤具有保护作用。然而，AP是否能对抗ZEN诱导的生殖毒性，其具体的分子机制尚不清楚。
本研究旨在利用猪睾丸（Swine Testis, ST）细胞模型，探究AP对ZEN诱导的细胞损伤是否具有保护作用，并利用转录组测序技术阐明其潜在的分子机制。
2. 材料与方法
2.1. 细胞培养与处理
实验选用猪睾丸（ST）细胞系（一种支持细胞系）。细胞在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素的MEM培养基中培养。为建立损伤模型，细胞用40 μM ZEN处理24小时。在AP+ZEN处理组中，细胞先用1 μM AP预处理24小时，随后与40 μM ZEN共处理24小时。
2.2. 细胞活力与毒性检测
使用CCK-8试剂盒检测细胞活力，使用EdU试剂盒检测细胞增殖，使用乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒检测细胞毒性。
2.3. 细胞周期与凋亡分析
使用流式细胞术分析细胞周期分布和细胞凋亡率。细胞凋亡检测采用Annexin V-FITC/PI双染法。
2.4. 氧化应激指标检测
检测细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和总抗氧化能力（T-AOC）水平。
2.5. 分子生物学检测
通过RT-PCR和qRT-PCR检测相关基因的mRNA表达水平，通过Western blot检测相关蛋白的表达水平。
2.6. 转录组测序与分析
对对照组（C）、ZEN处理组、AP+ZEN处理组和AP单独处理组的细胞进行转录组测序，筛选差异表达基因（DEGs），并进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。
2.7. 通路抑制实验
使用Wnt信号通路特异性抑制剂IWR-1-endo处理细胞，以验证AP的保护作用是否依赖于Wnt信号通路。
3. 结果
3.1. AP和ZEN对ST细胞活力的影响
首先，研究人员评估了不同浓度AP和ZEN对ST细胞活力的影响。结果显示，0.1至5 μM的AP能促进ST细胞增殖，其中1 μM和5 μM AP处理组的增殖率显著高于对照组。因此，选择1 μM AP作为保护性干预条件。相反，ZEN处理则呈剂量依赖性地抑制细胞增殖，40 μM ZEN能显著降低细胞增殖率，因此被选为建立细胞损伤模型的浓度。
3.2. AP对ZEN诱导的ST细胞活力下降的保护作用
在AP+ZEN处理组中，1 μM AP显著减轻了ZEN诱导的ST细胞活力下降。EdU细胞增殖实验进一步证实，AP显著缓解了ZEN诱导的细胞增殖抑制。此外，ZEN处理导致细胞培养上清液中LDH释放量显著增加，而AP干预则显著逆转了这一趋势，表明AP能有效缓解ZEN诱导的细胞毒性。
3.3. AP逆转ZEN对ST细胞周期分布的影响
流式细胞术分析显示，与对照组相比，ZEN处理组G1期细胞比例显著增加，S期细胞比例显著减少，表明ZEN诱导了细胞周期阻滞。AP干预则逆转了ZEN诱导的G1期阻滞，恢复了S期细胞的比例。Western blot和qRT-PCR结果进一步证实，ZEN显著降低了增殖细胞核抗原（PCNA）、细胞周期蛋白B1（CCNB1）和细胞周期蛋白A2（CCNA2）的表达，而AP干预则恢复了这些蛋白和基因的表达水平。
3.4. AP缓解ZEN诱导的ST细胞凋亡
Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术分析显示，ZEN处理显著提高了ST细胞的凋亡率，而AP干预则显著降低了ZEN诱导的凋亡细胞比例。Western blot分析发现，ZEN处理降低了抗凋亡蛋白Bcl-2和Caspase-3的表达，同时增加了促凋亡蛋白Bax的表达。AP干预则显著逆转了这些蛋白表达的改变。在转录水平上，ZEN显著下调了Bcl-2 mRNA的表达，上调了BAK和Bax的表达，而AP干预则恢复了这些基因的表达水平。
3.5. AP缓解ZEN诱导的ST细胞氧化应激和炎症
与对照组相比，ZEN处理显著降低了ST细胞中SOD活性和T-AOC水平，同时显著增加了MDA含量。AP干预则显著提高了SOD活性和T-AOC水平，并有效抑制了MDA的积累。此外，ZEN显著上调了白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的mRNA水平，而AP干预则使其表达恢复至接近基线水平。
3.6. RNA-Seq分析揭示AP逆转ZEN效应的分子机制
转录组测序分析显示，ZEN处理组与对照组相比存在4367个差异表达基因，而AP+ZEN组与ZEN组相比存在708个差异表达基因。KEGG通路富集分析发现，AP+ZEN组显著富集于Wnt信号通路。qRT-PCR和Western blot验证结果显示，ZEN处理降低了Wnt信号通路关键基因LRP5及其下游效应子c-Myc的表达，而AP干预则显著上调了LRP5、iASPP和TRAF2在转录和翻译水平的表达。
3.7. AP对ZEN诱导的ST细胞损伤的保护作用由Wnt信号通路介导
为了进一步验证AP的保护作用是否依赖于Wnt信号通路，研究人员使用了Wnt通路特异性抑制剂IWR-1-endo。结果显示，IWR-1-endo处理显著降低了AP对TRAF2、iASPP和LRP5表达的上调作用。此外，IWR-1-endo处理显著减弱了AP对ZEN诱导的细胞凋亡的保护作用，表现为促凋亡蛋白Bax和BAK的表达水平显著升高。
4. 讨论
本研究证实，ZEN对ST细胞具有显著的细胞毒性，表现为抑制细胞活力、诱导细胞周期G1期阻滞、促进细胞凋亡以及引发氧化应激。这些发现进一步证实了ZEN的生殖毒性。
AP作为一种常见的膳食黄酮类化合物，在本研究中表现出良好的保护作用。AP干预不仅显著缓解了ZEN诱导的细胞活力下降和细胞毒性，还逆转了ZEN引起的细胞周期阻滞和凋亡。在分子水平上，AP上调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，下调了促凋亡蛋白Bax的表达，并恢复了Caspase-3的表达。此外，AP还通过提高SOD活性和T-AOC水平、降低MDA含量，有效缓解了ZEN诱导的氧化应激。
转录组测序分析揭示了AP发挥保护作用的潜在分子机制。KEGG通路富集分析表明，Wnt信号通路在AP的保护效应中扮演了关键角色。Wnt信号通路在胚胎发育、组织稳态和细胞增殖中发挥重要作用。LRP5是Wnt/β-catenin信号通路中的一个重要共受体，其表达上调可以激活下游信号级联反应，促进细胞增殖并抑制凋亡。本研究发现，ZEN处理显著抑制了LRP5的表达，而AP干预则逆转了这一趋势，并上调了iASPP和TRAF2等关键蛋白的表达。
为了确证Wnt信号通路在AP保护作用中的必要性，研究人员使用了Wnt通路特异性抑制剂IWR-1-endo。结果显示，IWR-1-endo处理显著削弱了AP对Wnt通路相关蛋白（如LRP5、iASPP、TRAF2）的上调作用，并逆转了AP对ZEN诱导的细胞凋亡的保护效应。这充分证明，AP通过激活Wnt信号通路来发挥其对ST细胞的保护作用。
5. 结论
本研究证实，ZEN通过抑制LRP5表达，进而抑制经典的Wnt/β-catenin信号通路，从而诱导ST细胞发生氧化应激、细胞周期阻滞和凋亡。AP则通过上调LRP5表达，激活Wnt信号通路，有效缓解了ZEN诱导的细胞损伤。该研究不仅阐明了ZEN对雄性生殖系统的毒性作用机制，也为AP作为一种潜在的饲料添加剂，用于预防猪只霉菌毒素中毒提供了理论依据。
