《Journal of Clinical Microbiology》：Systematic evaluation and optimization of TaqMan qPCR assays targeting F57, ISMAP02, and IS900 for multiplex detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
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本综述系统评估并优化了针对副结核分枝杆菌（MAP）特异性基因靶点F57、ISMAP02和IS900的TaqMan qPCR检测方法，旨在开发一种高灵敏度、高特异性的多重qPCR（multiplex qPCR）检测方案。研究通过系统性文献回顾筛选出18种引物-探针组合，并在不同MAP载量的临床样本（粪便和环境样本）中进行验证。结果表明，在低菌量样本中，IS900-Herthnek和ISMAP02-Sevilla设计展现出卓越的诊断灵敏度，而多重检测策略有效提升了检测可靠性，为副结核病（Johne’s disease, JD）的精准诊断和牧场环境监测提供了重要技术支撑。
引言
副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, MAP）是反刍动物约翰氏病（Johne’s disease, JD）的病原体，也是一种潜在的人畜共患病原体，与克罗恩病（Crohn’s disease）以及其他人类疾病如炎症性肠病、自身免疫性疾病、结直肠癌和阿尔茨海默病有关。MAP感染的动物在亚临床阶段可长期无症状排菌，污染环境，而传统诊断方法如粪便培养和血清ELISA在早期感染和低菌量样本中灵敏度不足。分子检测方法，特别是定量PCR（qPCR），因其快速、灵敏和定量能力而受到青睐。本研究旨在遵循MIQE指南，开发一种针对MAP特异性基因靶点F57、ISMAP02和IS900的多重TaqMan qPCR检测方法，以提高诊断的准确性和效率。
材料与方法
研究首先对1990年至2024年5月8日期间发表的TaqMan qPCR研究进行了系统性回顾，通过多个数据库检索筛选出18种引物-探针组合，包括3种IS900设计（Herthnek、Kim、Slana）、2种ISMAP02设计（Irenge、Sevilla）和3种F57设计（Herthnek、Irenge、Ricchi）。通过in silico分析（如BLASTn）评估了引物和探针的特异性，并使用433株MAP野外分离株的全基因组序列验证了靶点拷贝数和序列一致性。qPCR反应采用SensiFAST Probe no-ROX试剂盒，在ABI 7500 Fast系统上进行，反应体系包含内参基因ACTB作为内部扩增控制（IAC）。检测限（LOD）和扩增效率（%Eff）通过MAP K-10基因组DNA的系列稀释进行评估。临床验证样本包括来自22个牧场的3,458头奶牛的12,087份粪便和血液样本，以及538份环境样本，这些样本根据MAP排泄水平分为低、中、高三组。
结果
In silico分析显示，所选引物和探针在MAP基因组中特异性良好，但某些设计（如F57-Slana和F57-Donaghy）因探针过短或易形成二聚体而被排除。在纯DNA检测中，所有18种多重组合均表现出接近100%的扩增效率和低检测限（IS900 LOD95为0.5 Ge，ISMAP02 LOD95为2 Ge，F57 LOD95为10 Ge）。然而，在低菌量临床样本中，IS900-Kim和IS900-Slana设计出现假阴性，而IS900-Herthnek的检测率达到81%。ISMAP02-Irenge在低菌量样本中产生不一致的Cq值（较IS900低6–7个循环），与基因组拷贝数预期不符，而ISMAP02-Sevilla结果可靠。F57作为单拷贝基因，在低菌量样本中检测信号易丢失，符合随机扩增规律。环境样本验证结果与粪便样本一致。最终确定的多重qPCR组合为IS900-Herthnek、ISMAP02-Sevilla和F57-Herthnek，其与单重qPCR结果高度一致（相关系数rc> 0.98），并能检测不同MAP基因型（如Bison型和Telford S型）。内参基因ACTB在所有样本中稳定表达，有效监控了DNA提取和qPCR过程。
讨论
本研究开发的多重qPCR assay通过同时检测多拷贝靶点（IS900和ISMAP02）和单拷贝靶点（F57），显著提升了MAP检测的灵敏度和特异性。在复杂样本基质中，某些引物设计（如IS900-Kim和ISMAP02-Irenge）因非特异性相互作用导致诊断灵敏度下降，凸显了在临床样本中进行验证的重要性。多重检测策略可通过比较各靶点的ΔCq值识别潜在假阴性，提高结果可靠性。此外，该assay能区分MAP与其他鸟分枝杆菌复合体（MAC）成员，如携带ISMAP02的Mycobacterium avium hominissuis（MAH），具有重要的流行病学意义。优化的DNA提取方法（含珠磨破碎）和SensiFAST master mix的使用确保了检测的重复性和抗干扰能力。
结论
IS900-Herthnek、ISMAP02-Sevilla和F57-Herthnek组合的多重qPCR assay在分析和诊断灵敏度方面均表现优异，适用于MAP感染的早期诊断、牧场环境监测和病原分型。该方案为副结核病的防控提供了高效、可靠的分子检测工具。
