重组鸭肠炎病毒载体疫苗通过快速诱导特异性细胞免疫为鸭群提供H5/H7禽流感早期保护

《Journal of Virology》：Recombinant duck enteritis virus harboring the hemagglutinin genes of influenza virus rapidly induces specific cellular immunity in ducks

本研究首次揭示了重组鸭肠炎病毒（rDEV-dH5/H7）在鸭体内诱导快速免疫保护的细胞免疫机制。研究发现，该疫苗在接种后7天即可显著上调IFN-γ和颗粒酶A（Granzyme A）的表达，并快速激活CD3+、CD8+和CD4+T细胞的增殖。更重要的是，在抗体尚未检测到的情况下，疫苗已能诱导出针对血凝素（HA）的特异性T细胞反应，这为理解活载体疫苗的早期保护效应提供了关键的机制证据。

　　

研究背景与目的

鸭是禽流感病毒（Avian Influenza Virus, AIV）在自然界中维持和传播的关键宿主，因此，提高鸭群的免疫覆盖率对于阻断禽流感病毒从野鸟向家禽传播至关重要。鸭病毒性肠炎（Duck Enteritis）是养鸭业中必须使用活疫苗进行预防的最重要传染病。基于此，研究人员此前构建了一种重组鸭肠炎病毒（Recombinant Duck Enteritis Virus, rDEV-dH5/H7），该病毒携带了两种H5病毒（GZ/S4184/17 [H5N6] 和 LN/SD007/17 [H5N1]）以及一种H7病毒（GX/SD098/17 [H7N9]）的血凝素（Hemagglutinin, HA）基因。动物实验表明，rDEV-dH5/H7在加强免疫后能诱导针对H5和H7病毒的强效且持久的血凝抑制（Hemagglutination Inhibition, HI）抗体，并对致死性DEV以及同源和异源的高致病性H5和H7流感病毒提供完全保护。

尤为重要的是，该疫苗在首免后7天即可诱导针对致死性DEV和流感病毒的快速、完全保护，尽管此时在鸭体内几乎检测不到针对DEV的中和抗体或针对H5和H7病毒的HI抗体。这一现象在之前构建的rDEVus78HA中也曾观察到。为了阐明这种快速免疫保护的潜在机制，本研究旨在全面描绘rDEV-dH5/H7及其亲本载体病毒所诱导的细胞因子表达谱、T细胞增殖以及特异性T细胞反应。

材料与方法

本研究使用的重组病毒rDEV-dH5/H7为前期构建，减毒DEV疫苗AV1222株（vDEV）购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。实验动物为SPF绍兴鸭，在4周龄和7周龄时分别肌肉注射两剂10⁵TCID₅₀的rDEV-dH5/H7、vDEV或等体积的磷酸盐缓冲液（PBS）。

细胞因子反应分析

研究人员在首免后第1天至第28天收集鸭的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）、法氏囊（Bursa of Fabricius, BF）、脾脏和肺组织，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测了10种细胞因子的mRNA表达水平，包括IFN-α、IFN-β、IFN-γ、颗粒酶A（Granzyme A）、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和IL-15。

T细胞扩增分析

在首免后第0天（接种前）至第91天，研究人员分离鸭的PBMCs，通过流式细胞术分析CD3⁺、CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD4⁺T细胞亚群在PBMCs中的百分比。实验前，首先验证了抗大鼠CD3单克隆抗体（mAb）与鸭CD3的反应性，确认其可用于鸭T细胞的检测。

特异性T细胞反应分析

在首免后第0天至第31天，研究人员分离鸭的PBMCs，并用灭活的全病毒抗原进行体外刺激，包括vDEV、GZ/S4184 (H5N6)、LN/SD007 (H5N1)、GX/SD098 (H7N9)以及这三种流感病毒抗原的混合物。同时，以灭活的H1N1病毒（WSN/1933）和新城疫病毒（La Sota株）作为不相关对照。刺激后，通过细胞内染色检测IFN-γ的表达，从而量化DEV特异性和HA特异性的CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD4⁺T细胞。

结果

rDEV-dH5/H7诱导的细胞因子反应

先天免疫反应在rDEV-dH5/H7和vDEV接种后立即启动。在四种组织中，所检测的细胞因子基因表达水平大多上调，且rDEV-dH5/H7诱导的细胞因子表达模式与vDEV高度相似。IFN-α和IFN-β是作用最早的细胞因子，其mRNA在PBMCs和法氏囊中于首免后第1天和第3天显著上调，在脾脏中于首免后第1天显著上调，并在首免和加强免疫后第7天恢复至正常水平。

最明显的是，IFN-γ和颗粒酶A在早期阶段在所有四种组织中均显著上调，且大多在首免后第5天达到峰值。在加强免疫后第3天，颗粒酶A和IFN-γ的mRNA水平在大多数组织中急剧增加，达到与首免后第5天相当的水平。在首免后第5天，两种疫苗组鸭的四种组织中IFN-γ mRNA水平比对照鸭高4.23至21.70倍；颗粒酶A mRNA水平比对照鸭高12.98至149.07倍。IFN-γ和颗粒酶A的mRNA水平在首免后第14天恢复至正常浓度。此外，IL-1β和IL-2的mRNA水平在首免和加强免疫后第3至5天在某些组织中上调，而IL-4、IL-6、IL-8和IL-15的mRNA水平在不同组织和接种后时间点表现出不同的趋势。

rDEV-dH5/H7诱导的T细胞扩增

rDEV-dH5/H7和vDEV均能诱导T细胞快速增殖。CD3⁺/PBMCs的百分比从首免后第3天开始增加，在首免后第13天，rDEV-dH5/H7和vDEV接种鸭的平均百分比分别从33.0%和33.4%急剧增加至62.0%和59.6%，并在试验结束（首免后第91天）前维持在较高水平。相比之下，对照动物的CD3⁺/PBMCs百分比维持在27.5%至32.0%之间。

CD3⁺CD8⁺/PBMCs的百分比在rDEV-dH5/H7和vDEV接种鸭中也迅速增加，从首免后第3天的4.0%增加至首免后第9天的16.2%。加强免疫后，该比例进一步增加。CD3⁺CD4⁺/PBMCs的百分比从首免后第7天开始持续增加，在首免后第17天，rDEV-dH5/H7和vDEV接种鸭的平均百分比分别从13.3%和13.4%增加至22.3%和23.3%。

数据显示，rDEV-dH5/H7和vDEV均能诱导快速的T细胞增殖，且两个接种组在所有时间点的CD3⁺、CD3⁺CD8⁺或CD3⁺CD4⁺T细胞百分比无显著差异。从首免后第7天开始，两个接种组鸭的PBMCs中CD3⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞百分比显著高于对照鸭。在rDEV-dH5/H7首免后第7天，PBMCs中CD3⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞的百分比分别增加至40.8%和12.9%，分别约为对照动物的1.4倍和4.1倍。

rDEV-dH5/H7诱导的特异性T细胞反应

当用vDEV抗原刺激PBMCs时，rDEV-dH5/H7和vDEV接种鸭的CD3⁺CD8⁺T细胞中的IFN-γ⁺细胞比例从首免后第3天开始立即增加，并在首免后第7天显著高于对照组。同时，CD3⁺CD4⁺T细胞中的IFN-γ⁺细胞比例从首免后第7天开始增加，并在首免后第14天与对照组相比显示出显著差异。加强免疫后，CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD4⁺T细胞中的IFN-γ⁺细胞比例进一步增加。这些发现表明，两种疫苗均能诱导强大的DEV特异性T细胞免疫，且rDEV-dH5/H7和vDEV之间无显著差异。

当用三种单一流感病毒抗原或其混合物刺激PBMCs时，rDEV-dH5/H7接种鸭的CD3⁺CD8⁺和CD3⁺CD4⁺T细胞中的IFN-γ⁺细胞比例从首免后第3天开始立即增加。值得注意的是，在三种流感病毒混合抗原刺激组中，CD3⁺CD8⁺T细胞中的IFN-γ⁺细胞千分比在首免后第3天已显著高于对照动物；在所有四种不同抗原刺激组中，该比例从首免后第7天开始均显著高于对照动物。CD3⁺CD8⁺T细胞中的IFN-γ⁺细胞千分比从首免后第7天的0.82‰和1.07‰逐渐增加至加强免疫后第10天的1.48‰和1.72‰。流感病毒混合抗原刺激的PBMCs中的IFN-γ⁺细胞比例略高于单一病毒抗原刺激组。此外，rDEV-dH5/H7接种鸭的CD3⁺CD4⁺T细胞中的IFN-γ⁺细胞数量也显著高于对照鸭，从首免后第7天开始，总CD3⁺CD4⁺T细胞中有0.29‰至0.42‰对四种不同抗原刺激产生反应。

值得注意的是，在用任何流感病毒抗原刺激时，vDEV接种鸭的CD3⁺CD8⁺或CD3⁺CD4⁺T细胞中的IFN-γ⁺细胞比例在所有测试时间点均未观察到增加。同样，在用H1N1病毒和NDV抗原刺激后也未观察到反应。这些数据表明，rDEV-dH5/H7能够诱导明显且快速的HA特异性T细胞免疫。

讨论

本研究首次阐明了vDEV和重组病毒接种后早期阶段的先天免疫反应和特殊T细胞增殖情况。研究发现，rDEV-dH5/H7和vDEV接种后立即启动了先天免疫反应和T细胞增殖，且两种疫苗之间无显著差异。IFN-γ和颗粒酶A在两次接种的早期阶段在所有四种组织中均明显上调。同时，rDEV-dH5/H7从首免后第3天开始快速激活CD3⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞增殖反应，并从首免后第7天开始激活CD3⁺CD4⁺T细胞增殖反应，其效力与vDEV相当。

更重要的是，针对DEV病毒粒子的特异性T细胞反应在接种rDEV-dH5/H7和vDEV后立即被激活，特异性CD8⁺T细胞从首免后第7天开始显著高于对照组。在用三种单一流感病毒抗原或其混合物刺激后，接种rDEV-dH5/H7的鸭体内的HA特异性CD8⁺和CD4⁺T细胞也从首免后第3天开始被激活。HA特异性CD8⁺和CD4⁺T细胞在首免后第7天观察到显著增加。值得注意的是，在三种流感病毒混合抗原刺激组中，HA特异性CD8⁺T细胞在首免后第3天已显著高于对照动物。加强免疫后，观察到更强的HA特异性CD8⁺和CD4⁺T细胞反应。

T细胞介导的免疫在宿主防御疱疹病毒中起主导作用，而CD8⁺T细胞在清除流感病毒感染和随后的宿主恢复中起关键作用。IFN-γ是由辅助性T细胞（Th1）和CD8⁺T细胞诱导的主要细胞因子，在抗病毒免疫中起关键作用。颗粒酶A在CD8⁺T细胞和NK细胞中表达，主要介导穿孔素依赖的细胞毒性作用。因此，研究人员推测，rDEV-dH5/H7诱导的特异性T细胞的快速反应和先天免疫反应共同赋予了针对致死性流感病毒和DEV的快速免疫保护。

当rDEV-dH5/H7感染宿主细胞并在其内进行复制周期时，它允许HA蛋白以天然构象进行从头合成。这些HA抗原随后被呈递给CD8⁺T细胞，而APC表面的加工抗原片段则激活CD4⁺T细胞。CD4⁺T细胞为B细胞和CD8⁺T细胞的启动提供共刺激信号。rDEV-dH5/H7能够诱导针对异源H5病毒的（交叉）保护性免疫，这可能与HA特异性CD8⁺T细胞反应相关，因为HA茎部含有保守的CD8⁺T细胞表位。此外，DEV与大多数禽流感病毒具有相似的目标器官，两者主要在鸭的肠道中复制，因此，减毒DEV疫苗是开发流感病毒载体疫苗的理想抗原递送系统。