《Microbiology Spectrum》：Application of ddPCR for diagnosis and treatment monitoring of visceral leishmaniasis patients: addition of an ultrasensitive tool to the diagnostic arsenal
ABSTRACT
由于可用于内脏利什曼病（VL）准确诊断和治疗监测的工具有限，因此，开发适用于流行地区的超灵敏分子诊断工具的努力仍在进行中。在这项评估研究中，我们报告了微滴式数字PCR（ddPCR）检测方法在VL诊断和治疗监测中的效率。总共收集了60名VL患者在给予抗利什曼病药物前的血液样本。治疗后，在治疗后30天和180天从每位患者收集血液样本。从同一流行区域收集了同等数量的健康对照受试者的血液样本。对从血液样本中提取的DNA进行qPCR和ddPCR，以检测和定量利什曼原虫DNA。两种分子方法在诊断VL患者时均表现出高灵敏度。此外，在三例被诊断为VL复发的VL病例中，在治疗后180天检测到利什曼原虫DNA。ddPCR在检测低至0.1个杜氏利什曼原虫寄生虫基因组当量/反应时显示出优异的分析灵敏度。凭借这种有前景的定量能力，ddPCR方法在确定临床样本中的寄生虫载量方面与qPCR检测显示出高度正相关性（r = 0.8）。除了值得称赞的灵敏度外，ddPCR也显示出绝对的特异性。研究结果证实了ddPCR在诊断和监测VL患者治疗方面的优异性能。然而，进一步的多中心研究是评估该工具在流行地区适用性的先决条件。
IMPORTANCE
这是首个报告使用微滴式数字PCR（ddPCR）用于内脏利什曼病患者诊断和治疗监测的研究。通过利用这种超灵敏工具，可以在不需要标准DNA材料的情况下对临床样本中的寄生虫进行绝对定量。最终，该方法将有助于监测内脏利什曼病（VL）患者的复发以及黑热病后皮肤利什曼病（PKDL）患者，这些患者在VL消除后阶段在疾病传播中起着关键作用。此外，该方法的成功建立将为检测和定量无症状携带者和白蛉媒介中的寄生虫铺平道路，这将加强流行地区内脏利什曼病的消除后监测。
INTRODUCTION
利什曼病是一种人畜共患的媒介传播疾病，由超过20种利什曼原虫寄生虫物种引起，寄生虫通过受感染的雌性白蛉叮咬传入人体皮肤。该病表现为三种主要形式，最严重的形式是内脏利什曼病（VL，也称为黑热病），影响内脏器官，特别是脾脏、肝脏和骨髓。如果不进行适当治疗，VL可能是致命的。全球有超过6亿人面临VL风险，其中孟加拉国、印度和尼泊尔合计约占全球内脏利什曼病负担的30%。考虑到在印度次大陆对抗这种地方性疾病传播需要有针对性的干预措施和协调努力，2005年启动了黑热病消除计划（KAEP）以消除内脏利什曼病。根据KAEP的愿景，孟加拉国政府于2008年在卫生和家庭福利部的监督下启动了国家黑热病消除计划。通过持续和协调的努力，孟加拉国于2023年获得WHO的正式认证，成为首个消除VL作为公共卫生问题的国家。尽管已经消除，但对于任何媒介传播疾病，如果感染源仍然存在，疾病很可能再次发生。
在印度次大陆，VL发病率遵循周期性模式，具有5-10年的高发病率期，随后是10-20年的低发病率期。防止疾病再次出现是一项挑战，特别是由于无症状个体携带残余感染并最终在社区中传播寄生虫。据观察，在一个指示病例周围，虽然有几个个体被感染但保持无症状，但这些个体中有相当一部分发展为黑热病。同样，VL复发病例可能有助于寄生虫传播。此外，相当一部分经治疗的VL病例发展为黑热病后皮肤利什曼病（PKDL），在流行间期传播疾病方面起着关键作用。在消除后时代，预计在流行地区仍会发生复发和散发性新VL病例，尽管频率较低。因此，由于在先前流行和低流行地区疾病 resurgence 的可能性很高，必须建立强大的监测系统以维持控制。
由于残余感染导致疾病再次出现，例如，尼泊尔尚未获得VL作为公共卫生问题消除的认证。一项研究表明，印度比哈尔邦的573个村庄在2018年报告了VL病例，尽管在2013-2017年期间没有报告黑热病，这些病例贡献了该州黑热病总负担的20%。此外，2018年在印度比哈尔邦的Kosra村发现了一次疫情爆发，该村曾被认为是黑热病的低流行区。这些例子表明了在孟加拉国维持消除状态方面防止潜在传播和疾病再次出现的重要性。
为了追踪社区中的传播和残余感染，在消除后阶段进行定期监测对于实现零传播目标至关重要。为了实现这一目标并加速监测活动，一种衡量残余感染的超灵敏诊断方法是不可或缺的。
目前广泛使用的用于检测VL病例的rk39快速检测试纸（RDT），由于在消除后阶段VL病例数量少，可能会失去其阳性预测值，这对疾病的准确诊断构成了挑战。此外，rk39 RDT在合并感染病例中也表现出低灵敏度，特别是在合并HIV感染的个体中。定量PCR（qPCR）等分子方法的进步克服了基于血清学方法的局限性。然而，对昂贵参考材料的需求、由于相对定量方法学导致的跨实验室、检测方法和操作员的结果差异，以及由于抑制剂影响导致的假阴性结果，可能会限制qPCR在消除后时代的使用。
为了克服qPCR的局限性，数字PCR（dPCR）已被开发为一种超灵敏检测工具。利用这种先进技术，可以对样品中的DNA量进行绝对定量，同时不需要依赖参考标准。此外，这种超灵敏技术甚至可以在单分子水平进行检测。考虑到这些多方面的优势，在过去几年中，QX200微滴式数字PCR系统（Bio-Rad）上的微滴式数字PCR（ddPCR）已稳步成为各个领域使用最广泛的ddPCR平台。
ddPCR技术正迅速取代实时qPCR，成为一种不依赖标准品或外部校准的有效DNA定量方法，并且已被证明稍微更稳健，特别是对于低靶标浓度。该方法对PCR抑制剂更具抵抗力，消除了使用技术重复的需要，这进一步提高了ddPCR相对于qPCR的功效。大量研究证明，在诊断疾病、监测微小残留感染和疾病进展方面，ddPCR比qPCR具有更高的分析/诊断灵敏度。
考虑到ddPCR卓越的定量能力，理论上可以将其开发并实施作为消除后时代残余感染监测策略的一部分。然而，在实施此类工具之前，必须了解该检测方法在检测临床病例方面的效率。因此，在本研究中，我们调查了ddPCR检测方法在VL患者诊断和治疗监测中的性能。
RESULTS
Study participants
收集样本的参与者的人口统计学和临床详细信息列于表1。在60名临床确诊的VL患者中，11名（18.33%）患者有VL既往史，没有患者在其一生中有任何PKDL病史。研究入组的病例中有36名（60%）为男性。VL和地方性健康对照的平均年龄分别为28.7岁（标准差：16.05）和30.2岁（标准差：13.63）。在VL患者中，59例脾肿大持续时间少于2周，而6例有肝肿大。所有入组研究的VL患者对治疗均有反应，并在治疗6个月后宣布临床治愈。然而，其中三例在完成治疗后1年内报告复发。
Performance of ddPCR assay
Linearity and limit of detection
通过定量已知寄生虫DNA的10倍系列稀释（七个独立点），对应于10,000至0.01个寄生虫基因组当量/反应，确定了ddPCR检测的线性。在10?4稀释度下，超过99.9%的微滴达到饱和。生成的标准曲线在六个稀释步骤范围内呈线性，相关系数（R2）为0.99（P < 0.0005）。在任何阴性对照中均未检测到信号。该检测方法检测到低至0.1个杜氏利什曼原虫寄生虫基因组当量/反应，相当于10飞克杜氏利什曼原虫基因组DNA。
Reproducibility
使用变异系数（CV）评估检测的重现性。为了计算批内和批间CV，将检测方法在六个10倍稀释系列（104–10?1）和临床样本中定量的每反应拷贝数使用log10(x+1)转换转换为对数值。拷贝数批内CV对于104为1.15%，103为0.47%，102为0.31%，101为1.72%，100为1.53%，10?1为87.5%。拷贝数在三个独立检测之间的批间CV对于104为0.76%，103为0.47%，102为0.31%，101为0.92%，100为7.41%，10?1为100%，对于六个临床样本分别为3.08%、1.02%、7.41%、11%、18.56%和0.68%。CV值表明，除了那些DNA拷贝数非常低的样本外，所有样本都具有高重现性。
Sensitivity and specificity of ddPCR and qPCR assays
发现ddPCR检测的灵敏度为100%（置信区间：94.04–100.00），并且在60名阴性对照（地方性健康对照[EHC]）中未观察到假阳性结果。ddPCR检测定量的DNA拷贝平均值为每反应1.53个拷贝。发现qPCR的灵敏度和特异性均为100%。qPCR检测定量的寄生虫载量平均值为每反应0.8个寄生虫基因组当量。
Comparison between ddPCR and qPCR assay
在检测杜氏利什曼原虫方面，ddPCR与qPCR检测显示出绝对一致性（kappa: 1, McNemar P = 1.00）。为了比较ddPCR和qPCR之间的寄生虫负荷，我们将qPCR检测获得的值通过乘以10、50和100转换为绝对拷贝数，并使用log10转换将其转换为对数值。在第一次转换（乘以10）的情况下，Bland-Altman分析表明ddPCR和qPCR检测之间存在极好的一致性（ICC = 0.8）。几乎所有的观察值都在95%一致性限度内，平均差异为0.06。另外两次转换（50和100）在两种检测之间产生相对较低的一致性，ICC值分别为0.5和0.4，平均差异较高，分别为0.76和1.06。此外，在寄生虫定量方面，观察到两种分子检测之间存在高度正相关性（R2= 0.602）。
The performance of molecular assays in disease monitoring
所有60名经治疗的VL患者在治疗完成后被监测1年，并使用1个月时间点（mtp）和6个月时间点的样本来评估ddPCR和qPCR检测的预后价值。在1个月时间点，两种检测方法均未检测到DNA拷贝，其中5%（3/60）的患者在6个月时间点被两种检测方法发现阳性，具有中等寄生虫载量，并且也出现了症状。在任何时间点，两种检测方法均未在健康对照中发现杜氏利什曼原虫DNA拷贝。
DISCUSSION
通过NKEP的整体努力，孟加拉国在验证阶段连续三年成功维持了VL（黑热病）消除状态，并于2023年获得消除认证。WHO在孟加拉国的当前路线图是到2025年实现零传播，到2030年实现无黑热病状态。当前消除后时代面临的挑战包括对来自非流行地区的疑似KA病例的追踪系统有限以及跨境监测有限。由于VL消除已经实现，由于资源缺乏，NKEP的主动病例检测工作可能难以持续。此外，在消除后时期，由于VL患病率降低，rk39 RDT的阳性预测值可能会下降。为了应对这些挑战，通过整合超灵敏监测工具来定制疾病追踪系统已成为WHO议程中最重要的焦点。
由于对这种被忽视的热带疾病的研究资金有限，准确检测利什曼原虫感染的现有手段有限。考虑到血清学方法的缺陷，已经开发了少数分子检测方法用于流行国家的VL诊断。然而，在不同环境下进行更广泛应用之前，仍然需要对分子方法进行标准化或协调。迄今为止，RPA检测是唯一在印度次大陆被广泛评估用于检测临床样本中利什曼原虫DNA的检测方法。进一步的研究正在进行中，以开发这种床旁检测的定量能力用于治疗监测。在流行国家的参考环境中，基于PCR的分子方法简化了VL的诊断，从而确保了患者的适当治疗。重要的是，VL复发的诊断变得准确，并且治疗监测成为可能。除了诊断之外，宿主监测在VL消除期间和消除后检测残余感染方面变得至关重要。在此期间，超灵敏工具对于监测 ongoing transmission 是不可或缺的。在本研究中，评估了一种第三代分子工具用于VL的诊断。
该研究最有前景的发现是ddPCR在检测临床确诊VL病例方面具有绝对的灵敏度和特异性。与我们目前的发现一致，Ramírez等人报告了ddPCR检测在检测克氏锥虫感染方面具有100%的灵敏度和特异性。此外，Cheng等人证明ddPCR检测在检测多菌型麻风患者中的分枝杆菌方面具有100%的灵敏度和特异性。此外，大量先前的研究报告了ddPCR检测在检测传染病方面具有更高的灵敏度，包括疟疾、结核病、念珠菌血症和人类血吸虫病。我们的ddPCR检测的检测限为0.1个寄生虫基因组当量/反应或约11个寄生虫/毫升，这远低于先前观察到的ddPCR诊断皮肤利什曼病的检测限100个寄生虫/毫升。
使用标准稀释进行的批间和批内重现性测试产生的CV或相对标准偏差证明了数据的优异精密度，大多数稀释度的CV <5%，除了最高稀释度。六个临床样本的批间重现性测试也显示出高精密度，大多数样本产生的CV <10%。通常，CV <5%表示高精密度，而CV >20%表示低精密度。几项先前的研究证明了ddPCR检测在较低CV值下具有更高的重现性。最低浓度下较高的CV值可能是因为分子检测在接近检测限时往往不稳定。Verheul等人在检测肌营养不良靶基因的ddPCR检测中展示了类似的发现。
正如预期的那样，qPCR检测产生了100%的灵敏度，如在先前的研究中观察到的那样。为了比较ddPCR和qPCR之间的寄生虫载量，我们将qPCR检测的寄生虫载量通过乘以10、50和100转换为目标基因（18S rRNA基因）的绝对拷贝数，以确定两种检测显示最佳一致性的 trade-off 拷贝数。根据先前的研究，目标基因在每个利什曼原虫寄生虫中存在10到100个拷贝。然而，从印度杜氏利什曼原虫分离株的完整和注释基因组序列中确定目标基因的数量会更具体。
在重现性测试中，对于含有1个寄生虫基因组当量/反应的100稀释度，ddPCR检测到8-20个拷贝，中位值为12个拷贝。Bland-Altman分析表明在每个寄生虫10个拷贝数时一致性最佳，所有观察值都在2个标准差限度内，平均差异为0.06。这低于临床显著变异性的可接受阈值。此外，ICC值也高于其他两次转换，这进一步证明了最佳一致性。这与先前的研究一致，这些研究也使用Bland-Altman分析来比较检测病原体的ddPCR和qPCR灵敏度。在本研究中，我们观察到ddPCR和qPCR检测之间的绝对一致性。类似地，Tedim等人在检测血浆样本中的SARS-CoV-2 RNA时证明了ddPCR和qPCR之间的极好一致性，他们也报告了检测到的拷贝数之间的高度相关性。Zhao等人在定量柑橘溃疡病菌时观察到了类似的相关性。
寄生虫的定量对于利什曼病患者的治疗监测至关重要。迄今为止，已经研究了大量直接和间接的生物标志物来监测治疗结果。在我们先前的研究中，我们显示抗rK39抗体有潜力预测经治疗的VL患者中VL复发和PKDL的发展。Kip等人的系统评价报告了几种用于治疗监测的抗原和抗体生物标志物。然而，发现寄生虫DNA是监测治疗结果最准确的生物标志物。迄今为止，一些临床试验已利用寄生虫DNA或qPCR作为药效学评估工具来确定VL患者血液中的寄生虫载量。在本研究中，我们首次评估了ddPCR作为VL患者在使用两性霉素B脂质体治疗后的治疗监测工具。由于现有抗利什曼病药物的可变疗效，正在努力开发新药。作为适当的治疗监测工具，ddPCR可以加速VL和其他形式利什曼病的药物开发途径。
在印度次大陆，推荐使用单剂量两性霉素B脂质体治疗方案治疗原发性VL病例。尽管该方案疗效卓越，但几乎10%的经治疗VL病例在治疗后6个月内复发。此外，5%-10%的治愈VL患者在2-4年内发展为PKDL，然后作为流行间期疾病传播的潜在储存库。因此，监测疾病的预后与早期准确检测病例以阻止传播和根除疾病同样重要。我们通过两种分子检测方法在1个月时间点和6个月时间点对经治疗的VL病例进行了随访。在1个月时间点后，所有患者均临床治愈，并且两种分子检测方法均未发现阳性病例。我们先前的研究也证明了使用qPCR作为诊断手段，有效治疗后治愈VL病例中循环寄生虫被清除。在6个月时间点，发现三例病例在qPCR和ddPCR检测中均呈阳性，尽管所有患者保持临床治愈。
由于所有VL患者都接受了抗利什曼病药物治疗，尚不清楚检测到的DNA是来自死亡还是存活的寄生虫。在这方面，阈值寄生虫载量可能为成功治疗或未来复发机会提供指示。然而，很难确定这样的寄生虫丰度 trade-off。在本研究中，复发患者被检测到非常少量的DNA。类似地，在我们先前的研究中，我们在PKDL患者的皮肤样本中发现了非常少量的寄生虫DNA。在复发病例中，未能实现完全的寄生虫清除，残余的活寄生虫以隐蔽状态存在于脾脏或骨髓中的白细胞内，并且在循环系统中水平非常低。这些实例清楚地表明，即使成功治疗后，极少量的活寄生虫也可以重新建立感染。因此，通过实时PCR/ddPCR在6个月时呈阳性的经治疗VL患者应受到密切监测或随访，以便在需要时进行进一步干预。
有几个因素可以促进病原体增殖和成功治疗后疾病再次出现，例如治疗后由于免疫抑制状况、HIV、结核病、营养不良导致的细胞免疫无效，和/或治疗不足，和/或耐药性。病原体严重改变树突状细胞和巨噬细胞的抗原加工和呈递能力，并利用一系列尚未完全理解的策略逃避免疫监视。几种细胞因子和免疫调节分子可能潜在地负责LD寄生虫的持续存在和疾病进展。在印度和苏丹，发现复发VL中杜氏利什曼原虫抗原特异性IgG1水平在治疗6个月后显著高于治愈病例。在印度比哈尔邦对VL患者进行的另一项研究表明，IL-10与高寄生虫载量和疾病严重程度显著相关。此外，一项在小鼠模型中的研究报告称，IL-4和IL-10诱导了TH2反应，这有助于寄生虫对数生长。在巴西，与未复发VL相比，复发VL患者在治疗后长达6个月内维持较低的CD4+T细胞和较高的IgG3水平。
几项过去的研究表明ddPCR在监测疾病进展方面具有有前景的优势。Roy等人阐述了ddPCR技术在监测PKDL患者中杜氏利什曼原虫感染疾病进展方面的潜力。ddPCR也被发现对于测量抗逆转录病毒疗法后的总HIV DNA和2-LTR环是高度准确和灵敏的。ddPCR的可靠性在监测急性早幼粒细胞白血病的微小残留病方面得到显示，并用于预测有疾病进展风险的费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病患者。其他几项研究也证明了ddPCR作为一种有效的疾病监测工具 upon treatment response。
尽管ddPCR在治疗监测方面具有卓越的效率，但目前这种超灵敏检测的成本和运行时间高于qPCR。内部使用ddPCR试剂的估计成本范围为每反应5美元至20美元，这似乎高于内部实时PCR的范围。然而，该方法的直接定量能力可以避免开发和购买昂贵的参考材料，这可以降低测试成本。此外，其对抑制剂的抵抗力可以消除对假阴性样本进行重复运行的需要，这可能会进一步减少时间和总体成本。此外，研究人员正在开发一种多重ddPCR检测，可以在小体积样本中检测多个靶标，这可以降低诊断成本，同时提高灵敏度并使诊断时间高效。在早期的一项研究中，多重ddPCR检测被证明比单重qPCR便宜三倍，并且在定量十二个批准的转基因玉米品系时节省了6个工作日的得出结果时间。ddPCR方法的全自动化可以进一步简化工作流程并减少手动操作时间，这将有助于最大程度地实施到常规临床使用中。
本研究发现ddPCR与qPCR相当，这可能为实施这种超灵敏工具用于VL患者诊断、治疗监测以及消除后时代残余感染监测铺平道路。该检测是一种合适的监测工具，用于追踪热点地区的疾病传播或再次出现，并识别潜在的新流行地区。此外，这种定量检测将有助于作为媒介监测的一种手段来衡量白蛉中的利什曼原虫感染。然而，在大规模应用之前，需要进一步的研究来确定这种超灵敏工具的适用性。
MATERIALS AND METHODS
Study design, sites, and participants
该研究是一项基于实验室的诊断评估研究，采用病例对照设计，使用存储在icddr,b的先前研究中可用的存档样本进行。研究参与者的纳入和样本收集是在他们相应的研究期间在Mymensingh区的Surja Kanta Kala-azar研究中心进行的，该区是VL的高度流行区，占孟加拉国VL总病例的一半以上。实验室活动于2022年1月至2023年12月在icddr,b的新发感染和寄生虫学实验室进行。总共评估了60例确诊VL病例和60例地方性健康对照（EHC）的样本，以确定ddPCR的诊断效率，VL病例定义为来自流行地区、脾肿大持续时间少于2周且rk39 RDT测试呈阳性的个体。此外，来自VL流行区的任一性别的个体，无VL/PKDL病史，临床健康，无任何严重急性或慢性疾病症状，包括VL和PKDL，且rk39 RDT阴性，被视为EHC。本研究中纳入的VL患者曾接受两性霉素B脂质体治疗，遵循国家指南，并且所有患者均被随访至治疗后1年。从相同患者收集和存档的血液样本通过ddPCR进行研究。在先前的研究中，在治疗前（基线）和治疗后两个时间点：30天或1个月时间点，和180天或6个月时间点从患者收集血液样本。
为了确定研究方法的诊断效率，本研究将VL诊断的国家指南以及有效的治疗反应视为金标准。在治疗6个月后但1年内出现症状复发的患者被视为复发病例。对应于确诊VL患者的DNA样本用于评估灵敏度，而健康个体的DNA样本用于确定ddPCR和qPCR检测的特异性。为了评估两种检测的预后价值，使用经治疗VL病例在1个月时间点和6个月时间点的血液样本的DNA分离物，通过qPCR和ddPCR检测利什曼原虫。使用存档的DNA样本进行
