《Bioresource Technology》：Construction of self-sustaining dual regeneration system through co-immobilized multienzyme and cofactor for sustainable 13-hydroxyoctadecadienoic acid synthesis
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本研究构建了自持的GSH-NADPH双重再生系统，整合水解-脂氧化-还原级联反应于单反应器，通过共固定化策略将多酶与辅因子结合于壳聚糖-鞣酸-Fe3+网络，实现13-HODE高效合成（产率760.0±13.3 mmol/mol亚油酸及433.37±7.09 mmol/mol豆油），系统循环稳定性达60.37%±0.80%，为可持续生物制造高附加值脂肪酸衍生物提供新平台。
刘晓晓|李凯|王鹏博|王坤|戴书涵|谢小曼|杨敏|徐莉|闫云军|闫金勇
中国华中科技大学生命科学技术学院，教育部分子生物物理学重点实验室，武汉430074
摘要
13-羟基十八二烯酸（13-HODE）的传统生物合成是一个多步骤过程，需要分别在不同反应容器中通过酶促反应生成13-羟基过氧十八二烯酸（13-HPODE），然后使用传统还原剂进行还原。为了解决这一挑战，我们构建了一个自维持的谷胱甘肽（GSH）-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）双重再生系统。该系统将水解-脂氧化-还原级联反应整合在一个反应容器中，从而为13-HODE的高效合成提供了可持续的还原力。我们开发了一种共固定策略，将多种酶（脂肪酶、脂氧合酶、谷胱甘肽还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）与NADPH辅因子共同固定在壳聚糖-单宁酸-Fe3+网络中。这种集成的一锅法系统实现了13-HODE的可持续合成，从亚油酸中获得了760.0 ± 13.3 mmol HODE/mol的产率，从大豆油中获得了433.37 ± 7.09 mmol HODE/mol的产率。共固定系统的产率大约是自由系统的两倍，并且在6个循环后仍保持了初始产率的60.37 ± 0.80%。这项工作建立了一个整合到水解-脂氧化-还原级联反应中的GSH-NADPH双重再生系统，为过氧化物的还原和GSH依赖的生物加工提供了一种方法。这种共固定策略为生产有价值的脂肪酸衍生物提供了一个可持续且高效的平台。
引言
脂肪酶-脂氧合酶级联反应可将油脂转化为脂质过氧化物（在氧气存在下），这些过氧化物可以进一步转化为羟基脂肪酸（例如通过还原）、仲脂肪醇（例如通过光脱羧酶）、风味化合物（例如通过过氧化物裂解酶HPL）和聚合物前体（例如通过醇脱氢酶ADH）（Cha等人，2021；Jeon等人，2018）。值得注意的是，13-羟基十八二烯酸（13-HODE）是一种由亚油酸过氧化产生的羟基脂肪酸，由于其独特的结构基团和多效的生物功能，在生物医学领域受到了广泛关注（Guimar?es和Venancio，2022；Kim和Oh，2013；Metzger和Bornscheuer，2006；Ogawa等人，2011；Shin和Byun，2024；Zhang等人，2021）。目前13-HODE的主要绿色合成策略依赖于两步酶促-化学级联反应（Cha等人，2021；Qi等人，2020）。最近的研究成功实现了Rhizopus oryzae脂肪酶（ROL）、脂氧合酶（LOX）和还原剂半胱氨酸的共固定，将其应用于大豆油的一锅法转化成13-HODE（Liu等人，2024）。在这个过程中，半胱氨酸被氧化成胱氨酸（?S–键），导致其还原能力不可逆地消耗。过量的初始半胱氨酸添加会损害固定材料的结构完整性。谷胱甘肽（GSH，γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸）通过其活性巯基（?SH）表现出还原能力（Clapp等人，2006；Liu等人，2023）。与半胱氨酸相比，GSH可以防止埋藏的二硫键的还原——特别是那些位于酶活性位点或对三级结构稳定性至关重要的二硫键（McBean，2017）。同时，GSH在整个实验时间内保持其还原能力（Banerjee，2012；McBean，2017）。受生物氧化还原系统的启发（Niu等人，2021），我们旨在开发一种基于GSH-NADPH双重再生系统的13-HODE合成方法，从大豆油中制备13-HODE（图1c）。尽管酶的固定为缓解多酶级联反应的局限性提供了有希望的策略（Hwang和Lee，2019；Liang等人，2021；Liu和Sun，2023；Shi等人，2018），但实现NAD(P)依赖的多酶系统的协调封装并有效回收辅因子仍然是一个巨大的挑战。Liang等人通过控制性的结构刻蚀策略开发了一种分层多孔金属-有机框架（MOF），有效地提高了多酶系统和辅因子依赖的酶促过程的生物催化性能（Liang等人，2021）。Liu等人的聚电解质辅助捕获方法（PAEA）的最新进展展示了在氢键有机框架（HOFs）中共固定带相反电荷的氧化还原酶和NAD(P)H（Liu和Sun，2023）。与合成聚电解质（如PAH）相比，壳聚糖（CS）具有更好的生物相容性、可生物降解性和可再生性，其固有的柔韧性和富含羟基的基质为酶提供了友好的微环境（Peniche等人，2003）。与金属-酚类网络（MPNs）相比，金属离子和酚类形成的网络具有更高的结构稳定性（Jiang等人，2025）。
在这里，我们建立了一个自维持的GSH-NADPH双重再生系统，与脂肪酶-脂氧合酶级联反应相结合。通过CSTAFe固定策略，首先利用CS的聚电解质性质组装酶和辅因子，然后将其封装在金属-多酚网络中（见补充材料）。这种共固定平台实现了从大豆油中的一锅法生产13-HODE，消除了对不可再生还原剂的依赖，实现了自主的辅因子循环。
节选内容
谷胱甘肽-NADPH双重循环级联系统设计
为了评估谷胱甘肽的还原能力，向两个不同的系统（最终体积1 mL）中加入50 μL 13-羟基过氧十八二烯酸（13-HPODE）乙醇溶液（浓度0.08 mM），缓冲液pH值为7.4的Tris-HCl。反应I仅依赖GSH（0.32 M）进行还原，而反应II则使用了一个包含GSH（0.16 M）、谷胱甘肽还原酶（GR，5 U/mL）和NADPH（6 mM）的酶促再生系统。对于氧化的谷胱甘肽（GSSG），反应混合物（总体积
GSH-NADPH双重再生级联系统的设计
为了验证所提出的GSH-NADPH双重再生还原机制，我们首先研究了在没有GR参与的情况下GSH直接还原13-HPODE的情况。高分辨率液相色谱-质谱（HR-LC-MS）分析证实了13-HODE的成功合成（见补充材料）。经过2小时反应后，产率为285.50 ± 16.35 mmol 13-HODE/mol 13-HPODE（见补充材料）。这一结果与已建立的机制一致
结论
本研究描述了一种在CSTAFe基质中的共固定酶-辅因子系统，通过水解-脂氧化-还原级联反应合成13-HODE。以亚油酸为底物，未固定ROL的系统（系统5）的13-HODE产率为760.0 ± 13.3 mmol/mol亚油酸。以大豆油为底物，固定系统（系统9）的产率为433.37 ± 7.09 mmol/mol亚油酸，大约是使用其他方法的两倍
未引用的参考文献
Omar, 2003; Zhang等人, 2021a; Zhang等人, 2021b.CRediT作者贡献声明
刘晓晓：写作 – 审稿与编辑，撰写原始草案，数据可视化，验证，软件使用，资源管理，方法学研究，数据分析，概念化。李凯：软件使用，方法学研究，数据分析。王鹏博：数据可视化，软件使用，方法学研究。王坤：软件使用，方法学研究。戴书涵：软件使用，方法学研究。谢小曼：项目监督，项目管理。杨敏：项目监督，项目管理。徐莉：项目监督利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（NSFC32170090）、武汉科技重大项目（2023020302020708）和武汉科技项目（2024030803010186）的资助。
