《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Food absence is a cue for metamorphosis in the solitary bee Megachile rotundata through a conserved physiological mechanism
编辑推荐：
本研究揭示了独居蜂Megachile rotundata以食物缺失（而非关键体重）作为变态启动信号的全新机制。通过分析保幼激素（JH）滴度、胰岛素/TOR信号通路及蜕皮激素合成相关基因表达，证实其虽生态触发因子特殊，但下游内分泌调控通路（如JH清除和20-羟基蜕皮酮脉冲）在昆虫中高度保守，为理解生活史策略如何塑造发育可塑性提供了范式。
Significance
在独居蜂Megachile rotundata中，研究发现食物移除，而非达到关键体重，是启动变态发育的信号。这一发现挑战了在模式昆虫中的研究结果，揭示了适应M. rotundata生活史的独特机制，其幼虫完全依赖母体提供的有限食物。食物移除降低了保幼激素（Juvenile Hormone, JH）水平，并激活了与其他昆虫在变态承诺期相似的内分泌通路，包括与蜕皮激素生物合成相关的转录本丰度增加，以及胰岛素/TOR信号的变化。尽管不同物种启动变态的信号可能不同，但我们的结果表明其基础的生理机制与其他昆虫相似。这项研究拓宽了我们对昆虫发育的理解，并强调了生活史如何塑造变态过程。
Abstract
昆虫变态发生的时间决定了成虫的体型大小，并影响其适合度，包括飞行性能和繁殖力。变态的调控在模式昆虫中已得到深入研究，但在其他昆虫中确定启动向变态生理转变的信号一直具有挑战性。在大多数昆虫中，关键体重是启动变态的信号。我们的目标是确定独居蜂Megachile rotundata变态的信号，并表征由该信号启动的生理机制。将幼虫蜜蜂分为自由取食组（也称为“饱食组”）或食物完全移除组（也称为“饥饿组”）。我们测量了启动变态的时间、保幼激素滴度以及参与变态内分泌反应的转录本丰度。我们通过局部施用前胸腺抑制素（precocene，一种干扰JH合成的化合物）来实验性操纵JH。我们发现M. rotundata没有关键体重，通过移除食物造成的饥饿触发了变态的启动。食物移除与低JH滴度相关，而施用前胸腺抑制素模拟了食物缺失的反应。食物移除降低了与JH产生相关的转录本，并增加了与蜕皮激素合成和胰岛素/TOR信号相关的转录本。食物缺失对M. rotundata幼虫来说是一个生态相关的信号，因为幼虫被供应了有限的食物且无法自行觅食补充。尽管M. rotundata以食物移除作为变态信号，但与变态相关的生理机制与其他昆虫相似。
引言
变态是从幼体形态到成虫形态的发育转变。在大多数全变态昆虫中，幼虫阶段的主要任务是生长和储存资源，而成虫阶段则侧重于繁殖。从幼虫到蛹的变态转变时间点结束了生长阶段，是成虫体型大小的强预测因子。为了成功完成变态，幼虫必须足够大并获取足够的营养以维持向下一阶段的转变。对于许多昆虫而言，向蛹期过渡起始时的体型大小称为关键体重，此时幼虫在生理上承诺进入变态。通过关键体重进入变态是许多全变态昆虫物种的常见机制。关键体重在模式物种Manduca sexta和Drosophila sp.中得到了深入研究，尽管两者对关键体重的反应有所不同。在一些昆虫中，最小存活体重被用作关键体重的替代指标。最小存活体重是幼虫能够成功蜕皮到蛹期的最小体型。虽然关键体重是一种常见机制，但也有一些文献记载的昆虫不使用关键体重来调控变态。例如，独居蜂Osmia lignaria不依赖关键体重，而是以食物缺失作为变态信号。这种机制可能常见于那些幼虫在亲代提供的有限食物资源上发育的物种，但其变态的生理基础是否与具有关键体重的物种不同仍属未知。
本研究的目的是表征独居蜂Megachile rotundata变态的调控并确定启动变态的信号。我们预测食物缺失可能是变态的信号，因为这是密切相关的独居蜂O. lignaria的信号，以及其他资源受限昆虫的信号。M. rotundata幼虫由母亲提供有限的食物，且无法自行觅食补充。我们通过操纵食物供应量并比较进入变态的时间，来检验是否存在关键体重机制。幼虫被分为提供过量食物组（“饱食组”）或所有食物被移除组（“饥饿组”）。我们还测量了最小存活体重。为了确定进入变态的生理机制，我们在喂食处理后测量了随时间变化的JH滴度。我们还通过施用JH拮抗剂前胸腺抑制素来操纵JH滴度，以确定JH在进入变态中的重要性。最后，我们测量了饥饿条件下参与JH合成与响应、蜕皮激素合成与响应以及胰岛素/TOR通路转录本的丰度。我们预测进入变态的信号是食物移除，并且不存在关键体重。其次，我们预测JH滴度会随时间下降，并且在饥饿蜜蜂中下降更快，表明食物移除启动了变态。最后，我们预测参与变态的转录本在饥饿后丰度会增加。我们假设JH通路中的转录本丰度会下降，并且在饥饿幼虫中下降更快，表明为向变态过渡做准备而清除了JH。我们预测蜕皮激素通路中的转录本丰度会增加，并且在饥饿处理中增加更快，表明饥饿幼虫更早启动了幼虫-蛹的蜕皮。我们选择测量胰岛素/TOR通路中的转录本，因为这些通路是营养感应通路，在生长速率和持续时间中发挥作用。虽然难以预测这些转录本的普遍模式，但我们预计转录本丰度会随时间下降，并且在饥饿幼虫中丰度更高，这是对低胰岛素信号以及为进入变态做准备的响应。总体而言，我们的预测得到了支持，表明尽管M. rotundata没有关键体重，但变态过程中涉及相似的生理过程。
结果
M. rotundata 没有关键体重
在第五龄幼虫的不同体重阶段移除食物，以确定饥饿是否影响开始结网（停止生长和承诺变态的行为指标）的时间。根据喂食处理，开始结网的时间有显著减少。饥饿的蜜蜂在食物移除后约24小时开始结网，比在其原始食物上喂养的对照组蜜蜂早约一天。自由取食的蜜蜂开始结网的时间晚于饥饿蜜蜂和对照组蜜蜂。
关键体重是指饥饿后不再影响变态时间的体重。通过断点分析检验了关键体重的存在，预期在关键体重处斜率会存在断点。然而，Davies检验表明，在任何处理中均未发现显著的断点。这表明M. rotundata不存在关键体重。我们还检验了变态时间与幼虫体重之间的线性关系。我们发现所有处理中，处理时的体重与开始结网的时间之间存在显著的负相关关系。在所有处理中，较小的幼虫需要更长的时间来启动变态。
最小存活体重是指50%的幼虫能够成功蜕皮到蛹期的体重。我们监测幼虫直至前蛹期，计算出最小存活体重为0.0186克，这处于第五龄初期幼虫的体重范围内。因此，M. rotundata在进入末龄时已接近能够存活到下一生命阶段的体重。
JH 介导向变态的转变
对于有关键体重的昆虫，一旦达到关键体重，JH开始下降以启动向变态的过渡。我们通过高效液相色谱法测量了饱食和饥饿幼虫的JH滴度。我们发现JH浓度与喂食处理之间存在显著关系。通过食物移除而饥饿的幼虫比自由取食的幼虫具有更低的JH滴度。JH似乎在下降，但在实验时间范围内没有显著变化。即使在第五龄初期，JH滴度也较低。在大多数昆虫中，从第四龄到第五龄的蜕皮需要高JH滴度以确保其不发生变态蜕皮。为了确定JH何时开始下降，我们测量了未达到第五龄的幼虫的JH滴度。第四龄幼虫的JH滴度显著高于第五龄幼虫。这些结果表明，JH滴度在幼虫蜕皮到第五龄后开始下降，并且饥饿幼虫的JH滴度低于饱食幼虫。
为了进一步阐明JH是否有助于变态承诺，我们用JH拮抗剂前胸腺抑制素处理第五龄幼虫。我们发现前胸腺抑制素处理对进入变态的时间有显著影响。经前胸腺抑制素处理的幼虫比对照组更早开始结网。然而，饥饿的幼虫比前胸腺抑制素组和对照组都更早开始结网。前胸腺抑制素诱导了结网，但不如饥饿迅速。这些结果表明JH信号减少确实影响了停止生长的时间，表明JH参与了M. rotundata的变态承诺。
转录本丰度对喂食处理的响应
转录本丰度分析的所有结果见补充材料。此处，我们展示JH、蜕皮激素和胰岛素/TOR通路中主要感兴趣转录本的结果。
JH 信号通路
我们测量了JH信号通路中基因的转录本丰度，以确定丰度是否会因食物移除而改变。由于食物移除后幼虫更早启动变态，我们预测喂食处理会有显著效应，并且喂食处理和时间之间可能存在显著的交互作用。对于参与JH合成的基因，法尼基二磷酸磷酸酶和法尼基脱氢酶的转录本丰度随时间下降。fppp显示出随时间显著下降，并且时间与处理之间存在显著的交互作用。fd显示出随时间和处理显著下降，但交互作用不显著。mfe的转录本丰度既不随时间变化，也不因喂食处理而异。这表明JH合成随时间在两种喂食处理中都在下降，并且在饥饿蜜蜂中下降更快。总体而言，这些转录本的丰度表明在末龄期间JH合成随时间减少，而食物移除加速了这一过程。JH受体Methoprene-tolerant在饥饿蜜蜂中具有更高的转录本丰度，并随时间增加。参与JH分解的基因 juvenile hormone epoxide hydrolase在自由取食的蜜蜂中转录本丰度更高，并随时间下降。早期JH响应基因Krüppel-homolog 1不受喂食处理影响，但随时间下降。结网状态是预测fd、jheh和met转录本丰度的显著因素。对于除fd和jheh外的所有转录本，处理时的体重并不显著，这表明JH信号通路的状态在末龄独立于体重。JH信号与体重无关进一步支持了M. rotundata不存在关键体重的结论。
蜕皮激素信号通路
许多与蜕皮激素合成和响应相关的转录本丰度随时间发生显著变化。参与蜕皮激素合成的基因，包括disembodied、shadow和shade，在丰度随时间变化和喂食处理方面表现出不同的模式。dib和shd在饥饿蜜蜂中转录本丰度增加，并随时间增加，且喂食处理和时间之间存在显著的交互作用。sad最初下降但随后增加，且不受喂食处理的显著影响。总体而言，这些结果表明蜕皮激素的产生随时间增加，并且在饥饿蜜蜂中产生更高。蜕皮激素受体和ultraspiracle的转录本丰度随时间增加，但不受喂食处理影响。与早期蜕皮激素响应相关并与蛹承诺相关的Broad-complex随时间增加，并且在饥饿蜜蜂中具有更高的转录本丰度。结网状态不影响任何与蜕皮激素信号相关的转录本丰度。这表明蜕皮激素通路独立于结网进行，其调控取决于在末龄的时间和食物状态。
胰岛素和雷帕霉素靶蛋白信号通路
胰岛素信号通路中的转录本丰度随时间显著增加，除了胰岛素样生长因子1。Igf1不受时间影响，但在饱食处理中显著更高。胰岛素样受体和Forkhead box protein O在饥饿蜜蜂中具有更高的转录本丰度。FOXO的丰度随时间增加而后下降。Target of Rapamycin转录本丰度随时间增加，并且在饥饿蜜蜂中丰度更高。TOR的丰度随结网而增加，但其他转录本均未受显著影响。Igf1的丰度随处理时的体重显著增加，但其他转录本均未受体重显著影响。
主成分分析和层次聚类
我们进行了主成分分析和层次聚类，以可视化所有34个实验基因在饱食与饥饿蜜蜂中随时间变化的转录本丰度动态。第一主成分解释了转录本丰度变异的37.8%，第二和第三主成分分别解释了12.7%。前五个主成分解释了67.6%的变异。层次聚类方法中的间隙统计量确定最佳聚类数为五个。层次聚类将个体分配到不同的簇中。基于层次结构的嵌套分支，簇1和簇2彼此更相似，簇4和簇5彼此更相似。当用PC1和PC2可视化时，簇1、2和4主要在PC1上不同，而簇3和5在PC2上不同。
我们使用线性混合效应模型来确定蜜蜂的簇分配是否受实验变量影响。完整模型解释了簇分配变异的77%，这是显著的，其中70%由固定效应解释。在模型中，蜜蜂是饱食还是饥饿显著影响簇分配，时间也是如此。喂食状态和时间之间存在显著的交互作用，这表明蜜蜂的喂食处理影响了其转录本丰度在96小时实验中的变化方式。结网状态也影响簇分配。结网是承诺变态的第一个外部可观察迹象，因此预计与内部转录本丰度的变化相关。处理时幼虫的体重对簇分配没有显著影响。处理时体重的非显著性表明变态进程独立于体重，并进一步证实了我们的结论，即M. rotundata不存在关键体重。
喂食处理、时间和结网状态的显著性在主成分分析图中直观可见。随着时间的推移，个体从PC1值低、PC2值中等开始，最终达到PC1值高、PC2值低。饥饿个体和结网个体具有更高的PC1值。支持层次聚类模型的是，个体的PCA转录本丰度谱受喂食处理后小时数的影响，并且这种响应因喂食处理而异。
讨论
M. rotundata的变态是由食物移除而非关键体重诱导的。M. rotundata缺乏关键体重与同科的另一种独居蜂O. lignaria相似。停止生长的时间受食物移除的影响，但不受处理时体重的影响，这不同于有关键体重的生物体的预期。我们发现饥饿加速了M. rotundata停止生长的时间，饥饿幼虫比自由取食的幼虫更早开始结网。我们在饥饿体重与变态时间关系的斜率中未检测到断点。斜率断点的存在及其发生时的体重是定义关键体重的方式。然而，昆虫在达到关键体重后对饥饿的反应有所不同。关键体重的原始定义是摄食不再改变变态时间点。然而，在果蝇中发现，关键体重后饥饿会加速变态时间，而Manduca sexta在达到关键体重后饥饿不会改变变态时间。由于饥饿可以改变停止生长的时间，关键体重采用了更广义的定义，即昆虫在生理上承诺变态的体型。在M. sexta中，关键体重与JH滴度下降相关，摄食和生长持续到幼虫在停止生长时达到最大体型。我们在M. rotundata中未检测到关键体重，但饥饿确实加速了变态承诺的时间，如在果蝇中所见。我们估计最小存活体重与末龄蜕皮初期的体重相似，表明M. rotundata幼虫在末龄蜕皮后不久就具备了启动变态的生理能力。数学模型表明，果蝇的关键体重可能是更早的大小依赖性发育转变的下游结果，可能对应于最小存活体重。这部分解释了为什么我们能够通过饥饿和过量喂养在切叶蜂科蜜蜂中产生广泛的成虫体型范围。
M. rotundata在末龄幼虫期似乎具有较低的JH滴度，尽管根据其他昆虫的情况，这种滴度水平并非没有先例。幼虫期高水平的JH维持幼虫状态，JH的下降在大多数昆虫中开始变态。在M. rotundata中，发现饥饿蜜蜂的JH滴度显著低于过量喂食的蜜蜂。JH可能在蜜蜂经历饥饿后清除得更快，表明变态的激素承诺发生得更快。JH滴度受喂食处理显著影响，但不受时间影响。这一结果可能是由于在处理时JH滴度已经较低，或者因为较小的幼虫没有提供足够的血淋巴用于分析，这使我们在每个时间点偏向于采样较大的个体。当我们比较倒数第二龄和末龄幼虫时，观察到JH滴度下降，表明在蜕皮到末龄后立即出现JH下降。虽然已确定JH在昆虫变态起始中发挥重要作用，但其重要性因昆虫物种而异。在黑腹果蝇中，JH在变态起始中作用很小或没有作用，并且会延迟但不阻止化蛹。我们通过用前胸腺抑制素实验性地启动变态来检验JH的重要性，前胸腺抑制素会敲低发育中幼虫的JH生物合成。前胸腺抑制素处理比对照组更快开始结网，但不如饥饿迅速。我们的结果与Helm等人的研究一致，该研究发现经前胸腺抑制素处理的O. lignaria蜜蜂比对照组更快启动变态，尽管该研究未包括饥饿处理。我们的结果表明JH滴度调控M. rotundata的变态承诺，并且当JH滴度低时幼虫会承诺变态。
我们还测量了转录本丰度，以监测变态承诺过程中对饥饿的生理变化。参与JH合成的转录本在饥饿幼虫中丰度较低，并且丰度通常随时间下降，表明JH清除在饥饿蜜蜂中发生得更早。与JH合成和响应相关的转录本下降滞后于JH滴度的下降，尽管实验处理和时间点相同。JH滴度在第五龄初期已经较低，但JH相关转录本尚未完全下降。滴度和转录本之间的时间差异可以通过转录本变化滞后于快速的激素变化来解释，或者是因为对滴度和基因表达采样了不同的个体。JH的下降在饥饿蜜蜂中似乎发生得更快，这由JH滴度和JH转录本证明，表明JH的下降在末龄幼虫期迅速发生并在转录水平上受到调控。 Juvenile hormone epoxide hydrolase 随时间下降，并且在自由取食的幼虫中丰度更高。这种模式可能表明自由取食的蜜蜂在实验时间范围内仍在主动清除JH。Methoprene-tolerant被认为是JH受体，对JH水平做出响应，并调控Krüppel-homolog 1，后者在JH存在时抑制变态。基于这些关系，我们预测Met和Kr-h1的转录本丰度都会随时间下降，并在喂食处理间存在差异。与我们的预期相反，Met转录本丰度随时间增加，并且在饥饿蜜蜂中更高。Kr-h1转录本丰度最初上升然后下降，但在喂食处理间没有差异。我们预期Kr-h1表达模式会与JH滴度模式平行。相反，Kr-h1转录本丰度随时间下降，但未显示喂食处理效应。我们确实观察到JH和Kr-h1都在下降，只是这些下降似乎没有同时发生。尽管Kr-h1被充分证实是JH信号的下游靶标，但解释滴度、转录本丰度和我们实验的功能证据之间的关系仍然复杂。这种差异的一种可能解释是JH信号动态和Kr-h1转录调控可能是组织特异性的，而我们全身采样方法可能掩盖了局部响应。虽然我们的Kr-h1结果不完全符合预测，但它们并不与我们关于JH调控进入变态决定的总体结论相矛盾。我们的结果可能类似于赤拟谷盗中所见，其中Met和Kr-h1的丰度在末龄幼虫期和前蛹期表现出小的波动。前蛹期Kr-h1转录本丰度的增加与Broad complex的上调相关。BR-C在幼虫-蛹蜕皮中上调，高BR-C水平是前蛹期和蛹期的标志。我们的结果也显示BR-C转录本丰度在饥饿个体中随时间增加。基因Chinmo在幼虫期表达并抑制变态。虽然本研究未能测量Chinmo的表达，但确定其丰度何时降低（表明幼虫期结束）将是有趣的。综上所述，这些数据证实了我们研究中的蜜蜂通过JH下降进入变态，并且这似乎在饥饿蜜蜂中比在自由取食的蜜蜂中发生得更快、更早。
蜕皮激素合成和响应中上调的基因与为变态蜕皮做准备而释放蜕皮激素相关。蜕皮激素通过调控向下一发育阶段蜕皮的时间来调控变态。在本研究中，转录本丰度的总体模式表明蜕皮激素合成随时间增加，并且在饥饿蜜蜂中发生更快，这对应于向蛹期蜕皮的过程。有趣的是，转录本丰度不受结网状态影响，这表明蜕皮激素增加独立于停止生长。在大多数昆虫中，末龄期间有多个蜕皮激素峰值。其中一个峰值导致停止生长。不幸的是，我们无法测量M. rotundata中的蜕皮激素滴度，因此无法明确检验蜕皮激素滴度与停止生长之间的关系。这将是未来工作的一个有趣方向。
胰岛素/TOR通路对于响应营养和激素信号调控昆虫生长和发育非常重要。高营养可用性激活IIS和TOR，促进幼虫生长并延迟变态。IIS/TOR还通过影响蜕皮激素产生在影响变态时间方面发挥关键作用。当昆虫取食时，胰岛素信号通路对碳水化合物水平做出响应。我们的结果显示48小时后转录本丰度增加。这很可能反映了变态承诺，因为到那时两种处理中的大多数幼虫都已开始结网，尽管许多转录本似乎也遵循预期的饥饿响应模式。胰岛素样生长因子不随时间变化，并且在饱食蜜蜂中转录本丰度更高，表明对取食的响应。胰岛素样受体随时间增加，并且在饥饿蜜蜂中比饱食蜜蜂具有更高的转录本丰度。这种模式在其他昆虫的营养剥夺后观察到。一种解释是饥饿减少了幼虫中胰岛素样肽的合成，导致InR上调。此外，FOXO是一种在低胰岛素信号下激活的转录因子，已被证明可诱导InR表达。在果蝇中，Puig和Tjian证明胰岛素处理可以逆转饥饿诱导的InR上调效应。此外，对其他昆虫的研究表明，InR突变会导致变态延迟，支持了IIS在调控变态时间中的作用。我们发现FOXO在饥饿蜜蜂中具有更高的转录本丰度，并随时间增加。FOXO在饥饿处理中在24至48小时之间达到峰值。在发育过程中，FOXO是IIS的负调控因子，并在变态蜕皮中发挥重要作用。FOXO的沉默会延迟或阻止化蛹。FOXO转录本丰度的这种增加与在这些时间点启动变态蜕皮一致。
雷帕霉素靶蛋白通路响应氨基酸营养信号并激活蛋白质合成。在果蝇中，TOR也影响蜕皮激素产生，并且对于变态期间的蜕皮激素峰值很重要，这通过TOR失活延迟变态得到证明。TOR在饥饿蜜蜂中具有更高的转录本丰度，并随时间增加丰度；这种趋势与我们研究中蜕皮激素合成相关的转录本一致。这些模式表明TOR如预测那样影响变态时间。胰岛素/TOR通路中其他基因的上调并未显示出基于喂食处理的清晰模式。IIS/TOR通路可能根据蜜蜂的取食状态扮演不同的角色。虽然IIS/TOR对于控制幼虫生长很重要，但我们看到许多IIS/TOR通路中的转录本在饥饿蜜蜂中丰度更高。虽然使用mRNA表达提供了有关基因调控和转录丰度的宝贵信息，但它也有局限性。例如，IIS通路通过磷酸化级联进行调控，而不是在转录水平，因此转录本丰度中看到的模式可能不直接反映生物体的生理状态。mRNA也不总是与蛋白质水平直接相关，并且通常是时间快照。我们可以利用本研究中的转录本结果来了解变态过程中该通路的模式。基于这些数据，饥饿的蜜蜂比自由取食的蜜蜂更早经历变态起始。
聚类分析包括了研究中的所有转录本，而不仅仅是结果中讨论的那些。总体转录本丰度受时间点和喂食处理的影响，饥饿个体经历与饱食个体相似的PC1和PC2组合，但时间点更早。虽然蜜蜂在特定小时数后采样，但它们不一定处于相同的发育阶段，因为饥饿蜜蜂发育进展更快。例如，与被采样时，饥饿幼虫中有更多个体已经开始结网，相比之下，过量喂食的幼虫则较少。到96小时的最终时间点时，饱食和饥饿个体具有相似的转录本丰度模式，大多数个体都已开始结网。这些转录本丰度模式强化了JH滴度的模式，并表明饥饿通过相似的基因通路引起变态提前开始，就像在
