《International Immunopharmacology》：Long-term NIR-light-controlled sustained release of PDGF-BB microsphere alleviates osteoarthritis with a single dose via the PI3K/AKT/GSK-3β/SOX9 Axis
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智能药物递送系统PB@BPNSs@CS实现PDGF-BB长达五个月的可控释放并可通过近红外光调控，单次注射显著缓解小鼠OA症状，通过激活PI3K/AKT信号通路抑制GSK-3β和SOX9降解，促进软骨再生。
王向江|韩贤静|韩家莉|刘如豪|黄浩|刘敖东|张润锋|何晓英|何文涛|王如仁|黄世峰|李宏义|张大伟|王桂清
广州医科大学附属清远医院（清远人民医院），中国清远511518
摘要 背景 关节内注射（IA）是治疗骨关节炎（OA）的关键药物给药方法。然而，通过这种途径给予的药物会被滑膜迅速清除，降低了药物的生物利用度，因此需要频繁注射。此外，不同OA患者的关节软骨损伤程度各不相同，这突显了迫切需要一种能够响应OA进展的智能、可控的药物输送系统。血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）能够促进软骨生成，具有治疗OA的潜力，但其在中关节腔内的半衰期较短，限制了其效果。
方法 PDGF-BB通过静电相互作用与二维黑磷纳米片（2D BPNSs）结合。使用透射电子显微镜表征了BPNSs和PB@BPNSs的形态。通过Zeta动态光散射测量其多分散指数和Zeta电位。采用能量分散X射线光谱元素映射和ELISA检测验证了结合效率。使用油包水包油双乳液法制备了PB@BPNSs@CS。通过ELISA检测评估其持续和可控释放的能力。使用Cell Counting Kit-8试剂盒评估PB@BPNSs@CS与ATDC5细胞的生物相容性。通过内侧半月板手术构建了小鼠OA模型。使用Safranin O快速绿色染色、免疫化学和Alcian blue染色检测评估PB@BPNSs@CS对OA的治疗效果。此外，还分析了人类软骨样本以进一步确认这些发现并评估所识别信号通路的治疗潜力。通过Western blot和免疫荧光检测探讨了潜在的分子机制。
结果 PB@BPNSs@CS能够实现PDGF-BB的长期持续释放，持续时间超过五个月，并且释放受到近红外光（NIR）的控制。重要的是，单次给药即可缓解小鼠的OA症状。从机制上看，PDGF-BB通过激活PI3K/AKT信号通路促进软骨生成，进而抑制GSK-3β，最终减少培养的软骨生成细胞和小鼠OA中的SOX9降解。此外，在人类OA软骨组织中，磷酸化的AKT、GSK-3β和SOX9的水平也有所降低。
结论 PI3K/AKT/GSK-3β/SOX9轴在OA中起着重要作用。PB@BPNSs@CS通过抑制SOX9的降解来维持PDGF-BB的释放，提高其生物利用度，并通过PI3K/AKT/GSK-3β轴增强其在OA中的治疗效果。值得注意的是，PB@BPNSs@CS的治疗效果可以通过近红外激光进行控制。
引言 骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病，主要影响30岁及以上的成年人。2020年，全球有7.6%的人口（即5.95亿人）患有OA。预计到2050年，每个受影响地区的OA患病率可能增加48.6%至95.1%[1]。因此，OA对患者和社会都带来了重大负担。不幸的是，目前的OA治疗方法往往不能令人满意。目前，OA药物主要通过口服、静脉注射或关节内注射（IA）给药。IA注射因其能够将药物局部输送到关节而受到青睐，从而将全身副作用降到最低。然而，由于滑膜组织的存在，药物在关节腔内的清除速度很快，导致药物生物利用度低[2]。这种快速清除不仅降低了治疗效果，还因频繁给药而增加了治疗成本和注射部位炎症的风险[3,4]。此外，OA可能由多种因素引起，不同患者的关节软骨损伤程度也各不相同。这些因素带来了重大挑战，凸显了迫切需要能够根据OA进展持续和控制药物释放的智能药物输送系统。
近年来，二维（2D）纳米材料因其出色的物理化学性质和生物相容性，在生物医学研究中成为输送生长因子的流行载体。与传统载体相比，2D纳米材料（如石墨烯、黑磷和过渡金属硫属化合物）具有较大的表面积和优异的机械强度，能够高效装载生长因子和蛋白质药物[2]。其中，二维黑磷纳米片（2D BPNSs）因其独特的性质（包括高表面积、生物相容性和光热能力）而受到广泛关注。值得注意的是，2D BPNSs在体内可轻易降解为无毒的磷酸盐，这对骨骼再生非常重要[5]。
在生物体内，大多数蛋白质药物（包括生长因子）通常带有负电荷，因为它们的等电点低于生理pH值[6]。许多2D材料（包括BPNSs[7]、石墨烯[8]、MoS2 [9]和WSe2 [10]）在这种条件下也带有负电荷。因此，大多数2D材料在没有功能化处理的情况下无法与亲水性生长因子结合。功能化涉及引入特定的功能基团（如氨基、羧基或磷酸基团）[7]，从而增强与生长因子的结合能力。然而，这一过程面临复杂性、生物相容性可能改变以及与有毒副产物相关的安全问题[11]。因此，寻找具有相反电荷的合适载体和治疗药物，基于简单的静电相互作用建立输送系统将是有益的。
血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）在OA中的作用越来越受到关注。作为血小板衍生生长因子家族的一员，PDGF-BB在关节组织中广泛表达[12]。研究表明，PDGF-BB可以促进软骨细胞增殖[13]、迁移[14]和细胞外基质（ECM）的合成[15]，表明其在缓解OA中的治疗作用。然而，PDGF-BB支持OA治疗的潜在机制尚不清楚。最近的研究表明，马尾藻多糖可以通过激活PI3K/AKT信号通路来缓解大鼠的OA[16]。此外，PDGF-BB已被发现可以在多种细胞类型中激活PI3K/AKT信号通路，包括软骨细胞[17]、血管平滑肌细胞[18,19]、内皮细胞[20]和神经元[21]。此外，先前的研究表明，GSK-3β（PI3K/AKT信号通路的下游靶点）可以磷酸化SOX9，SOX9是参与软骨生成的关键转录因子[22]。这种磷酸化会导致SOX9降解[23]，从而抑制软骨生成。因此，PI3K/Akt/GSK-3β信号通路可能在PDGF-BB介导的OA缓解中起重要作用。
OA治疗的另一个重要挑战是药物向软骨的输送不足。传统的关节内注射（IA）由于药物清除迅速而受到限制，需要频繁给药。一项先前的研究表明，大鼠需要四次给药才能缓解OA[24]。值得注意的是，PDGF-BB带有正电荷，这表明可以通过简单的静电相互作用将其有效地结合到2D材料输送系统中。
在这项研究中，我们开发了一种有效的PDGF-BB输送方法用于OA治疗。首先，PDGF-BB通过静电相互作用被吸附到2D BPNSs（PB@BPNSs）上。然后，这些复合物被封装到壳聚糖微球（PB@BPNSs@CS）中，这不仅稳定了PB@BPNSs，还显著增强了其可控释放能力。PB@BPNSs@CS表现出优异的生物相容性和稳定性，实现了PDGF-BB的长期释放，持续时间超过五个月。此外，PDGF-BB从PB@BPNSs@CS的释放可以通过近红外（NIR）照射进行控制。重要的是，PB@BPNSs@CS通过调节PI3K/AKT/GSK-3β/SOX9轴促进软骨生成并缓解小鼠模型中的OA。这种策略有潜力显著改善OA治疗。
部分片段 人类患者样本 所有实验方法均遵循《赫尔辛基宣言》中规定的原则。人类组织样本的收集和处理得到了广州医科大学附属清远医院（清远人民医院；IRB-2024-110）医学伦理委员会的批准。患者已充分了解研究内容，并在签署书面知情同意书后提供了组织样本。本研究共收集了10个患者的软骨样本
PB@BPNSs的表征 使用ProtParam数据库确定PDGF-BB的等电点为9.38（
https://web.expasy.org/protparam/ ）。这表明该蛋白质在生理pH值下带有正电荷（图S1）。相比之下，BPNSs在水环境中带有负电荷，表明它们可以与PDGF-BB发生静电复合。TEM分析显示BPNSs具有片状形态（图1a），平均尺寸为242.6纳米（图1b）。与PDGF-BB孵育后，EDS
讨论 在这项研究中，我们提出了一种简单有效的PDGF-BB可控、持续释放的方法来治疗OA。此外，我们展示了PDGF-BB促进软骨生成和缓解OA的新机制。我们的主要发现如下：1）BPNSs无需功能化即可与PDGF-BB紧密结合。2）PB@BPNSs@CS实现了激光控制和超长期释放PDGF-BB，持续时间超过5个月。3）PI3K/AKT信号通路下调，而GSK-3β
作者贡献 GQW、DWZ和HYL：概念构思、研究设计、监督、撰写——审阅和编辑、项目管理。XJW、XJH、JLH：验证、撰写——初稿、方法学、数据管理、正式分析。GQW、XJW、XJH和HYL：资金获取。RHL、HH、ADL、RFZ、XYH、WTH、RRW和SFH：验证、正式分析、方法学。所有作者均批准了提交的版本。
CRediT作者贡献声明 王向江： 撰写——初稿、验证、方法学、资金获取、正式分析、数据管理。韩贤静： 撰写——初稿、验证、方法学、资金获取、正式分析、数据管理。韩家莉： 撰写——初稿、验证、方法学、正式分析、数据管理。刘如豪： 验证、方法学、正式分析。黄浩： 验证、方法学、正式分析。刘敖东： 验证、方法学、正式分析。
资助 本研究得到了清远人民医院医学研究基金（PA1c1ee205380526）、清远人民医院临床研究专项基金（QYRYCRC2023010）、广东省医学科学技术研究基金项目（A2023257）、清远市科技计划项目（2022KJJH031、2022KJJH028）以及广州医科大学2022年学生创新能力提升计划的支持
利益冲突声明 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢 我们感谢广州医科大学附属清远医院（清远人民医院）的实验动物中心在动物实验中提供的支持。
