《International Journal of Biological Macromolecules》：RASSF9: A modulator of PAR3 condensates in polarity signaling
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细胞极性核心蛋白PAR3通过液液相分离（LLPS）调控功能，而RASSF9作为其新相互作用伙伴，通过促进PAR3 LLPS维持细胞极性和抑制致癌信号。病理突变E58K、H60R破坏RASSF9-PAR3相互作用，削弱LLPS效应，提示该轴在肿瘤进展中起关键作用。
徐俊|张一清|文文宇
复旦大学上海医学院生物医学科学研究所，华山医院神经外科，上海医学遗传学重点实验室，脑功能与疾病国家重点实验室，教育部脑科学前沿中心，中国上海200032
摘要
顶端-基底极性的建立对于上皮组织的完整性和功能至关重要。核心极性蛋白PAR3（Partitioning defective 3）在极性复合体的组装中起着关键作用，从而维持细胞的极性。虽然液-液相分离（LLPS）最近被证实是调控PAR3空间组织的关键机制，但这一过程的具体调控机制仍大部分未知。本研究通过生化实验发现，RASSF9（属于Ras-关联结构域家族）是PAR3的一个新的相互作用伙伴。在肺鳞状细胞癌中，RASSF9的E58K和H60R突变显著破坏了RASSF9与PAR3之间的相互作用。此外，纯化的RASSF9蛋白在体外能够发生液-液相分离。值得注意的是，RASSF9能够强烈促进PAR3的相分离，显著增强PAR3凝聚体的形成和大小。RASSF9与其相互作用能力的缺陷会降低其对PAR3相分离的促进作用。我们的研究结果表明RASSF9是PAR3凝聚体的调节因子，并提出了一种可能通过相分离来维持细胞极性和抑制致癌信号传导的机制。
引言
细胞极性表现为细胞成分的时空不对称分布，对发育和组织稳态至关重要[1,2]。核心极性蛋白复合体（如PAR3-PAR6-aPKC复合体）的精确组装对于建立和维持细胞极性是必需的[3][4][5]。这些极性蛋白的失调常常与癌症中的异常信号传导相关，表明它们是重要信号通路的交汇点[6][7][8][9]。其中，RAS信号通路是最强的致癌驱动因素之一。大量证据表明，顶端-基底极性的破坏（如Scribble或PAR3蛋白的丢失）会导致RAS-MAPK通路的过度激活，从而促进肿瘤发生[10][11][12][13]。例如，Scribble的丢失不仅会与致癌的KRAS协同作用加速多种组织的肿瘤进展，还会通过招募磷酸酶等机制直接影响RAS-ERK信号通路[14][15][16]；同样，PAR3的缺失会与HRAS协同作用促进转移行为[13]。这种功能上的相互作用在进化上是保守的，例如果蝇中的极性蛋白Canoe能够同时激活RAS-MAPK和JNK通路，促进组织过度生长[17]。总体而言，这些研究将极性蛋白视为关键的信号调节者，其功能障碍往往会通过与RAS通路的协同作用释放潜在的致癌潜力。
PAR3作为PAR复合体的核心支架蛋白，对于上皮细胞和神经元的极性建立至关重要[3,5,18,19]。尽管PAR3的表达水平较低，且与其结合伴侣的相互作用较弱[13][20][21][22]，但液-液相分离（LLPS）是一种高效的PAR3核化蛋白复合体组装机制[19]。LLPS使生物分子形成动态的无膜凝聚体，从而在空间上组织关键细胞过程，包括基因表达、细胞极性和信号转导[23][24][25][26][27][28][29][30][31][32][33]。最近的研究发现，PAR3的寡聚化和与PAR6的相互作用驱动了其相分离，这一过程在果蝇神经母细胞的不对称细胞分裂（ACD）中对于细胞极性的建立至关重要[19]。Ccdc85c蛋白被发现能够激活PAR3的凝聚，将极性与Notch信号通路耦合起来，进一步强调了LLPS作为PAR3整合多种信号的关键机制[34]。这一机制在癌症研究中尤为重要。在肺腺癌中，PAR3的表达下调会激活14–3-3ζ/Tiam1/Rac1通路，提高Rac1-GTP的水平，从而促进JAK-STAT信号通路，加速肿瘤增殖和转移[35]。值得注意的是，Rac1是与RAS-MAPK通路交叉的关键节点，从而放大致癌信号[36]。大约8%的肺鳞状细胞癌（LUSC）携带PARD3突变，这些突变会破坏紧密连接并触发异常的RAC1/STAT3激活[37]。这些发现支持了一个统一的模型：PAR3的丢失会破坏细胞极性，并通过Rac1介导的RAS-MAPK信号通路的增强来促进肿瘤进展。然而，直接将RAS信号通路与核心极性机制（尤其是PAR3）联系起来的分子桥梁仍不明确。
有趣的是，RASSF9（属于RAS-关联结构域家族）能够直接与活化的RAS结合[38][39][40]，成为潜在的调节因子。RASSF9在不同类型的癌症中对RAS-MAPK通路表现出依赖上下文且有时相反的调节作用[38,39,41,42]。在非小细胞肺癌中，RASSF9的表达上调，通过激活MEK/ERK通路促进肿瘤细胞增殖[40]；而在乳腺癌中，RASSF9的表达下调，其低表达与晚期肿瘤和其他恶性临床特征相关[43]。食管癌的研究表明，TAK1介导的RASSF9 Ser284位点的磷酸化会抑制RAS-MEK-ERK信号通路，表明RASSF9可作为RAS信号通路的负调控因子[44]。这些发现表明RASSF9是一个多功能的结构蛋白，其失调会以组织特异性方式显著影响肿瘤进展。关于果蝇感觉器官前体（SOPs）的ACD研究表明，SOP特异性的RASSF9/10同源物Meru与PAR3同源物Baz相互作用，在Fz/Dsh的极性信号引导下不对称地定位，并促进Baz向后皮层的募集[45,46]。鉴于PAR3和RASSF9都通过参与RAS信号通路来调节肿瘤发生，我们推测它们可能通过同一通路来调控细胞极性和组织稳态。
在本研究中，我们探讨了RASSF9与PAR3之间的潜在功能联系。通过生化实验验证了人RASSF9与PAR3之间的直接相互作用，并发现LUSC中RASSF9的E58K和H60R突变会显著破坏其与PAR3的相互作用。此外，我们发现RASSF9的RA结构域能够参与相分离。更重要的是，我们证明了RASSF9可以有效地被招募到PAR3凝聚体中，进而进一步促进PAR3的相分离。RASSF9上影响其与PAR3相互作用或相分离能力的突变会降低其对PAR3凝聚体的促进作用。这项工作不仅发现了一个新的PAR3凝聚体调节因子，还为PAR3-RASSF9通路如何维持细胞极性和抑制致癌信号传导提供了潜在的机制解释。
部分摘录
RASSF9与PAR3的相互作用
使用GEPIA2（
http://gepia2.cancer-pku.cn/#index ）分析TCGA和GTEx数据库后发现，LUSC组织中的RASSF9 mRNA表达水平显著高于正常肺组织（图1A）。这一结果与先前报道的LUSC中PAR3突变和下调的情况相反[37]。这两种RAS相关蛋白在同一肿瘤类型中的相反表现促使我们探究它们在LUSC中的潜在功能相互作用。
讨论
蛋白质凝聚体作为一种新的生物大分子自组装形式，提供了比传统蛋白质复合体更精细和多样的调控机制[30,49]。因此，除了直接干扰目标蛋白的结合外，调节其相分离凝聚体的动态也成为影响蛋白功能的重要途径。作为细胞极性的关键调节因子，PAR3在建立和维持细胞极性中起着关键作用。
蛋白质表达与纯化
重组蛋白在Escherichia coli Rosetta宿主细胞中表达，随后通过Ni亲和层析（SMART Lifesciences）和尺寸排阻层析（SEC，使用HiLoad 26/600 superdex 75/200柱子，AKTA FPLC系统，GE Healthcare）进行纯化。纯化的蛋白储存在含有50 mM Tris（pH 8.0）、100 mM NaCl、1 mM β-Mercaptoethanol（β-Me）和1 mM EDTA的缓冲液中。用于GST pull-down实验的PAR3/RASSF9结构域被标记了GST-His6 、Trx-His6 或MBP-His6 。
CRediT作者贡献声明
徐俊： 撰写——原始稿件、可视化、验证、实验设计、数据分析、数据管理。
张一清： 撰写——原始稿件、可视化、验证、实验设计、数据分析、数据管理。
文文宇： 撰写——审稿与编辑、撰写——原始稿件、项目监督、资源协调、资金获取、数据管理、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
我们感谢文文宇实验室的所有成员提供的帮助。本研究得到了国家重点研发计划（2025YFA1308802）和国家自然科学基金（32494762、32370733、82121004）对W.W.的支持。
