Trichoderma reesei纤维素酶分泌过程中COPII核心组分功能的分解研究

《International Journal of Biological Macromolecules》：Functional dissection of the roles of COPII core components in Trichoderma reesei cellulase secretion

COPII介导的早期分泌途径在Trichoderma reesei纤维素酶高效分泌中起关键作用，Sar1 GTP酶突变体导致分泌缺陷并激活内质网应激，Sec24 B位点特异性调控纤维素酶分泌，而Lst1主要参与纤维素酶Xyn1的分泌。

　　

王志兴|夏雨晓|刘卫峰

青岛大学材料科学与工程学院生物化学工程研究所，中国青岛市266071

摘要

Trichoderma reesei是主要的木质纤维素酶工业生产菌，但其高产蛋白质分泌的分子机制，尤其是COPII介导的早期分泌途径，仍研究不足。本文通过多种遗传操作手段解析了T. reesei中核心COPII组分的纤维素酶分泌功能。过表达恒活性COPII调节因子GTP酶Sar1 H74L会导致严重的菌丝生长缺陷，同时抑制纤维素酶和木聚糖酶的分泌，增强内质网应激标记基因的表达。与Sar1不同，T. reesei的COPII适配器同源物具有功能特异性，表现出不同的亚细胞定位和对酶分泌的不同影响：Trsec24的敲低会抑制纤维素酶分泌，而Trlst1的缺失则没有明显的分泌缺陷。通过突变和竞争性抑制实验进一步证实Sec24 B位点对纤维素酶分泌至关重要。值得注意的是，Trlst1和Trsec24都对木聚糖酶Xyn1的分泌不可或缺，而任一基因的敲低对Xyn2的分泌影响较小。这些发现有助于我们更深入地理解T. reesei的早期分泌途径，揭示其卓越的蛋白质分泌能力背后的细胞机制。

引言

在微生物系统中异源表达重组蛋白已成为满足全球蛋白质市场需求的有效方法，尤其是在制药蛋白、食品添加剂和工业酶领域[1,2]。在各种微生物宿主中，丝状真菌因其出色的蛋白质分泌能力和复杂的翻译后加工机制而备受关注[3]。特别是Trichoderma reesei，作为一种被认定为安全的（GRAS）生物，因其无与伦比的木质纤维素酶分泌效率而被广泛用于工业酶生产[4]。然而，目前T. reesei中异源蛋白的产量与天然酶存在显著差异：天然酶的产量可超过100克/升，而重组蛋白通常只有几克/升[5]。由于限制T. reesei异源蛋白分泌的根本因素尚未明确，系统研究其进化优化的纤维素酶分泌机制对于阐明其高产蛋白能力至关重要。

蛋白质分泌是细胞生理过程中的基本环节，负责将约30%的细胞蛋白输送到细胞外环境或内膜系统[6]。在传统的蛋白质分泌途径中，新合成的肽最初通过信号识别颗粒（SRP）依赖途径或非依赖途径转运到内质网（ER）。经过内质网驻留的伴侣蛋白折叠和初步的翻译后修饰后，只有正确折叠的蛋白质才能进入高尔基体进行最终糖基化（N-/O连接）和分选[7]。从内质网到高尔基体的转运由包裹有COPII复合体的特殊球形囊泡介导。COPII组装级联反应由Sec12激活的Sar1 GTP酶触发，随后招募Sec23-Sec24内层结构，最终招募Sec13-Sec31外层结构在内质网出口位点形成COPII囊泡[8,9]。作为COPII囊泡生物发生的关键调节因子，Sar1在所有物种中都至关重要，尽管其在酵母和哺乳动物中的基因拷贝数存在差异[10,11]。功能上，Sar1作为GTP激活的分子开关，通过精确调控GTP电荷和水解来控制蛋白质的浓度、囊泡分裂和脱壳[12]。研究表明，不可水解的GTP类似物和恒活性Sar1突变体（酵母Sar1 H77L和哺乳动物Sar1 H79G）在体外和体内均阻断了蛋白质运输[11,13]。

蛋白质装载到COPII囊泡的效率是决定最终分泌效果的关键因素。虽然默认的“批量流动”允许某些蛋白质随机进入COPII囊泡，但选择性分选系统可显著提高细胞内运输效率[14,15]。其中，COPII适配器亚基Sec24通过双重识别策略发挥关键作用：某些跨膜蛋白可直接与Sec24结合，而可溶性分泌蛋白通常需要特定的分选受体介导的桥梁作用[16]。结构适应性强的Sec24异构体能够扩大底物范围，同时保持严格的选择性[17,18]。在Saccharomyces cerevisiae中，基因组同源物的扩展产生了包括Sec24、Sfb2/Iss1和Sfb3/Lst1在内的多种Sec24异构体[17]，这些异构体通过不同的结合界面实现超过800种蛋白质的分选[18,19]。

最近在丝状真菌中蛋白质分泌机制的研究进展也突显了早期分泌途径的重要性。Neurospora crassa通过不同的途径协调ER分选受体p24和Erv29，分别促进外葡聚糖酶CBH-1和CBH-2的高效输出[20]。我们在T. reesei中的研究进一步证明了p24和Erv29介导的分选途径的互补性，两者同时缺失会完全阻断纤维素酶的分泌[21]。尽管取得这些进展，丝状真菌中COPII囊泡组分的详细功能研究仍十分有限，远落后于酵母中已建立的复杂机制模型[19]。尽管在Aspergillus nidulans中有一些遗传学研究证实了核心COPII组分（如Sar1和Sec24）在蛋白质分泌中的关键作用[22,23,24]，但其底物选择性和调控机制仍需进一步研究。此外，关于关键Sec24适配器亚基的功能数据也十分匮乏[25,26]。尽管T. reesei以其出色的蛋白质分泌能力而闻名，但其COPII机制在各种水解酶超分泌中的具体功能尚不清楚。因此，阐明T. reesei中COPII机制的适应性不仅有助于我们理解其卓越的蛋白质分泌能力，还能为这种工业重要真菌的分泌蛋白生产提供理论指导。为此，我们综合多种策略解析了T. reesei中的COPII介导的纤维素酶分泌过程，确定了Sar1调控、Sec24/Lst1的功能差异以及Sec24 B位点的特异性是纤维素酶生产不可或缺的因素。

Sar1对T. reesei的生长和菌丝形态形成至关重要

作为COPII外壳组装的主要调节因子，Sar1对于研究早期分泌机制至关重要。我们最初尝试在T. reesei中生成sar1敲除同核体未获成功，这与A. nidulans中的致死表型一致，证实了其在真菌中的非冗余必要性。

讨论

三十多年来，COPII介导的蛋白质转运被认为是传统蛋白质分泌途径（CPS）的主要调控中心[31]。然而，新的证据揭示了多种非传统的蛋白质分泌途径（UPS，类型I-IV），挑战了这一传统观点[32]。这些新发现将研究重点转向了工业生产中蛋白质分泌的未知领域。

结论

综上所述，我们的研究表明Sar1对T. reesei的细胞存活和分泌功能至关重要，它将蛋白质转运与应激反应性转录调控联系起来。我们还发现了两种COPII适配器异构体之间的功能差异：Sec24主要负责纤维素酶的批量分泌，而Lst1与Sec24共同参与特定蛋白质的运输。特别是Sec24 B位点在纤维素酶分泌中起着关键作用。

菌株、培养基和培养条件

使用Escherichia coli DH5α进行质粒构建和扩增，培养条件为溶源菌肉汤（37°C，200 rpm）。T. reesei亲本菌株QM9414Δpyr4来源于QM9414（ATCC 26921），通过删除尿苷营养标记pyr4获得[40]，并在添加了10 mM尿苷的麦芽提取物琼脂（Sigma-Aldrich）上维持培养。

缩写说明

sfGPF
绿色荧光蛋白
Ptcu1
tcu1启动子
pNPC
p-硝基苯基-β-D-纤维二糖
pNPG
p-硝基苯基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷
CMC
羧甲基纤维素

CRediT作者贡献声明

王志兴：撰写初稿、数据可视化、软件使用、实验设计、资金申请、数据整理。夏雨晓：软件使用、实验设计。刘卫峰：撰写修订稿、监督工作、资源提供、方法学设计、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

感谢山东大学微生物技术国家重点实验室生命与环境科学核心设施的Sen Wang在荧光显微镜分析方面的协助。W. L.获得了国家重点研发计划（https://service.most.gov.cn/sbksdy/的资助（项目编号：2019YFA0905700），以及国家自然科学基金（http://www.nsfc.gov.cn/）的资助（项目编号：31970029和324770062），还有国家重点内部联合项目的支持。