通过代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum），使其能够在不依赖维生素B12的情况下生产3-羟基丙酸

《Metabolic Engineering》：Metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum for vitamin B 12-independent production of 3-hydroxypropionic acid

3-HP生物合成研究开发出维生素B12不依赖的工程菌株，通过β-丙氨酸途径优化和转运蛋白调控，实现126.3 g/L的高产，产率0.36 g/g，发酵效率达1.75 g/L/h。

　　

Moon Cheon Woo | Ghiffary Mohammad Rifqi | Prabowo Cindy Pricilia Surya | Kim Hyun Uk | Lee Sang Yup

代谢与生物分子工程国家研究实验室，化学与生物分子工程系（BK21四项计划），KAIST生物世纪研究所，KAIST，大田，34141，韩国

摘要

3-羟基丙酸（3-HP）是一种多功能平台化学品，具有广泛的应用，既可作为合成高价值化学品的前体，也可用于生产可生物降解的聚合物。然而，目前工业上3-HP的生产依赖于化学合成方法，这种方法需要使用有害的原材料和苛刻的反应条件。作为一种可持续的替代方案，微生物合成3-HP的方法受到了越来越多的关注。然而，大多数已报道的合成途径仍然受到维生素B₁₂依赖性的限制，而维生素B₁₂是一种昂贵的辅因子，这限制了其在工业应用中的可扩展性。在这里，我们报告了一种Corynebacterium glutamicum菌株的开发，该菌株通过引入一种不依赖维生素B₁₂的β-丙氨酸衍生途径，能够高效地从葡萄糖发酵生产3-HP。首先筛选了将β-丙氨酸转化为3-HP的候选基因，然后将优化的途径引入到之前开发的过量产生β-丙氨酸的BAL10菌株中。通过消除竞争性途径以增加前体的可用性，重新定向碳流经戊糖磷酸途径以改善辅因子平衡，加强β-丙氨酸的生物合成途径，并鉴定出一个先前未被表征的3-HP转运蛋白并调整其表达，最终工程化的菌株在高接种量分批发酵中产生了126.3克/升的3-HP，产率为0.36克/克葡萄糖，总体生产率为1.75克/升/小时。这些结果证明了不依赖维生素B₁₂的途径用于高产3-HP的可行性，突显了其在可持续和可扩展工业应用中的潜力。

引言

3-羟基丙酸（3-HP）是一种高价值平台化学品，既可作为多种工业重要化合物（包括1,3-丙二醇（1,3-PDO）、马来酸和丙烯酸）的多功能前体，也可作为生产聚合物和树脂的构建块（Song等人，2016年）。特别是，3-HP作为一种单体，因其可生物降解性、生物相容性和优异的机械性能而受到广泛关注，成为石化塑料的有希望的替代品（Andreeβen等人，2014年；Gao等人，2014年）。然而，目前工业上3-HP的生产主要依赖于从石油原料开始的化学合成过程，这导致了涉及有毒前体和苛刻反应条件的环境问题（Jiang等人，2009年）。为了解决这个问题，人们进行了大量研究，试图利用微生物宿主建立基于生物的方法来生产3-HP，这些方法具有温和的反应条件、高选择性和较低的环境影响（表1）。

3-HP的生物合成可以通过三条主要途径实现：甘油途径、马来酰辅酶A途径和β-丙氨酸途径（图S1）（Valdehuesa等人，2013年）。其中，甘油途径具有相对较短且高效的转化路径，包括甘油脱水生成3-羟基丙醛，随后将其氧化为3-HP，因此甘油途径已被广泛用于各种微生物中生产3-HP。例如，通过筛选最优的醛脱氢酶并优化其表达水平，一种工程化的大肠杆菌菌株从甘油中产生了76.2克/升的3-HP（Kim等人，2020年）。在一种工程化的肺炎克雷伯菌菌株中，通过过表达编码醛脱氢酶的puuC基因（该基因在tandem重复的P_tac启动子下表达），实现了102.6克/升的3-HP产量（Zhao等人，2019年）。然而，甘油脱氢酶对昂贵的维生素B₁₂的依赖性成为工业应用的主要瓶颈。为了解决这个问题，人们探索了使用包括葡萄糖（Liu等人，2016年）、乙醇（Lu等人，2022年）和乙酸（Chang等人，2021年）在内的各种碳源，通过马来酰辅酶A途径生产3-HP而不需要维生素B₁₂。例如，通过改造酿酒酵母的线粒体以增强辅因子和马来酰辅酶A的储备，从葡萄糖中产生了71.09克/升的3-HP（Zhang等人，2023年）。然而，3-HP的生产往往受到细胞内马来酰辅酶A可用性低（其受到严格调控以支持细胞生长）以及生物合成途径对ATP/NADPH依赖性的限制（Marienhagen和Bott，2013年；Janβen和Steinbüchel，2014年；Palmer等人，2020年）。另一方面，β-丙氨酸途径提供了一个有吸引力的替代方案，它提供了一种不依赖维生素B₁₂的途径，并具有较高的理论产量（Wang等人，2023年；Borodina等人，2015年）。例如，使用工程化的酿酒酵母通过β-丙氨酸途径生产3-HP，在1升的台式发酵器中实现了25克/升的产量（Lis等人，2019年）。此外，大肠杆菌和Corynebacterium glutamicum也通过β-丙氨酸途径从葡萄糖生产3-HP，分别在分批发酵中的产量为31.1克/升（Song等人，2016年）和47.5克/升（Wang等人，2024年）。此外，通过过表达NADP⁺依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶来调节还原能力，使工程化的大肠杆菌从甘油中产生了72.2克/升的3-HP（Batista等人，2024年）。

尽管之前进行了大量的代谢工程研究，但3-HP的产量、产率和生产效率仍然不足以满足工业需求。为此，我们通过不依赖维生素B₁₂的β-丙氨酸途径对Corynebacterium glutamicum进行了工程改造，以实现高效生产3-HP。选择C. glutamicum作为微生物宿主，是因为它天然具有较高的氨基酸生物合成通量，尤其是L-天冬氨酸的生物合成通量，而L-天冬氨酸是β-丙氨酸的直接前体。我们之前构建了一种高效的β-丙氨酸生产菌株，能够在分批发酵中产生166.6克/升的β-丙氨酸，表明其作为高产3-HP的微生物宿主的强大潜力（Ghiffary等人，2022年）。从β-丙氨酸到3-HP的生物合成途径包括两个酶促步骤：首先由β-丙氨酸转氨酶催化β-丙氨酸转化为马来酸半醛（MSA），然后由3-羟基酸脱氢酶将MSA还原为3-HP。我们首先筛选了将β-丙氨酸转化为3-HP的L-天冬氨酸氨基转移酶，以优化辅底物的使用，然后基于过量产生β-丙氨酸的C. glutamicum菌株增强了β-丙氨酸的生物合成途径。通过消除竞争性途径、增加戊糖磷酸途径的通量以及调节β-丙氨酸生物合成中的关键基因表达，优化了前体和辅因子的储备。为了进一步提高3-HP的产量，我们新鉴定了一种由NCgl2832基因编码的3-HP转运蛋白，并调整了其表达，以平衡细胞生长和分批发酵过程中的3-HP外排。最后，进行了高接种量分批发酵，以证明工程化的C. glutamicum菌株在不需要维生素B₁₂的情况下从葡萄糖独立生物合成3-HP的潜力。

部分内容片段

培养条件

对于大肠杆菌菌株，使用了Luria-Bertani（LB）培养基（10克/升NaCl、10克/升色氨酸和5克/升酵母提取物）和LB琼脂（添加了1.5%（w/v）琼脂）。在需要时，补充了25微克/毫升的卡那霉素（Km）或200微克/毫升的壮观霉素（Spc）用于筛选程序。对于C. glutamicum菌株，使用了含有91.1克/升D-山梨醇和37克/升脑心浸出物（BHI）的BHIS培养基。NCM培养基（17.4克/升K₂HPO₄、11.6克/升NaCl、5克/升葡萄糖、5克/升色氨酸）

确定3-HP生物合成的最佳酶和宿主菌株

通过β-丙氨酸途径从葡萄糖合成3-HP的途径如图1A所示。从L-天冬氨酸生产3-HP包括三个酶促步骤：首先由L-天冬氨酸脱羧酶将L-天冬氨酸脱羧为β-丙氨酸，然后由β-丙氨酸转氨酶将β-丙氨酸转化为马来酸半醛（MSA），最后由3-羟基酸脱氢酶将其还原为3-HP（Song等人，2016年；Borodina等人，2015年）。鉴于C.

结论

在这项研究中，我们开发了一种C. glutamicum底盘菌株，通过不依赖维生素B₁₂的β-丙氨酸途径实现高效生产3-HP。我们首先通过筛选具有有利辅底物特异性的β-丙氨酸转氨酶来构建和优化3-HP的生物合成途径。通过质粒过表达pyd4基因以及BspanD和ydfG基因，提高了3-HP的产量。随后，筛选了过量产生β-丙氨酸的C. glutamicum BAL菌株

CRediT作者贡献声明

Cheon Woo Moon：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，方法学，研究。 Mohammad Rifqi Ghiffary：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，方法学，研究。 Cindy Pricilia Surya Prabowo：撰写 – 原始草稿，验证，研究。 Hyun Uk Kim：撰写 – 原始草稿，监督。 Sang Yup Lee：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念化。

统计分析

我们没有预先确定样本大小。所有菌落都是从含有约100–200个菌落的平板中随机选取的，并进行独立的 flask 培养和化学分析。平均值使用双尾Student's t检验进行比较。P值表示为?P < 0.05、??P < 0.01或???P < 0.001，这些值被认为是显著的。所有数值数据均以三次实验的平均值 ± 标准差（SD）的形式呈现。研究者对组别分配不知情

利益冲突声明

致谢

这项工作得到了国家研究基金会支持的下一代生物精炼厂项目（2022M3J5A1056117）的微生物细胞工厂平台技术开发以及韩国科学与信息通信技术部支持的领先生物制造产业项目（RS-2024-00399424）的先进合成生物学源技术开发的支持。本手稿的修订使用了生成式AI工具ChatGPT 4o。作者们希望