68Ga/Gd-CBT-PSMA：一种用于前列腺癌原位自组装增强PET/MRI混合成像的新型纳米平台

《ACS Nano Medicine》：Enhanced PET/MRI Hybrid Imaging of Prostate Cancer with In Situ Self-Assembled 68Ga/Gd Nanoplatform

本文开发了一种前列腺特异性膜抗原（PSMA）靶向小分子探针68Ga/Gd-CBT-PSMA，该探针在进入前列腺癌细胞后，可被谷胱甘肽（GSH）触发发生共自组装，形成纳米颗粒（68Ga/Gd-NPs），从而同时增强T1加权磁共振成像（MRI）和正电子发射断层扫描（PET）信号，为前列腺癌（PCa）的精准诊断提供了新策略。

　　

引言

前列腺癌（Prostate Cancer, PCa）是男性泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤，其诊断主要依赖穿刺活检，但该方法存在准确性有限和固有手术风险等局限性。因此，基于生物标志物的无创诊断策略应运而生，旨在提高诊断的精确性。其中，靶向前列腺特异性膜抗原（Prostate-Specific Membrane Antigen, PSMA）的小分子正电子发射断层扫描（Positron Emission Tomography, PET）示踪剂已显示出显著的临床价值。放射性核素⁶⁸Ga因其衰变特性和半衰期与肽类及小分子放射性药物的药代动力学特征高度匹配，成为标记低分子量配体的理想选择。

PET/MRI混合成像系统的引入，通过在一次扫描中整合代谢PET数据和高分辨率解剖MRI数据，进一步改变了临床实践。相较于传统的PET/CT，PET/MRI提供了卓越的空间分辨率和软组织对比度，能够更精确地定位前列腺癌。此外，MRI的多参数功能（如弥散加权成像）提供了超越解剖结构的补充诊断信息，同时显著降低了患者的电离辐射暴露，提高了安全性。

然而，目前报道的大多数双模态PET/MRI探针是在独立的扫描仪上进行评估，这阻碍了混合成像实际优势的验证。此外，传统的小分子探针易被快速代谢，而纳米探针则往往存在递送效率低下的问题，导致生物利用度差和成像灵敏度有限。因此，设计能够克服这些局限性的新型PET/MRI探针至关重要。细胞内自组装策略是一种有效的解决方案，即小分子探针在进入肿瘤微环境后，被肿瘤特异性刺激物激活，在细胞内自组装成纳米结构，从而增加局部浓度和滞留时间，提高成像灵敏度和延长成像窗口。

基于此，本研究开发了一种PSMA靶向的小分子探针⁶⁸Ga/Gd-CBT-PSMA，它利用PSMA介导的内化和谷胱甘肽（Glutathione, GSH）诱导的共自组装策略来增强前列腺癌的混合PET/MR成像。该探针在选择性结合过表达PSMA的前列腺癌细胞后，发生GSH触发的6-氨基-2-氰基苯并噻唑-半胱氨酸（CBT-Cys）点击缩合反应，形成⁶⁸Ga/Gd-CBT二聚体，并通过π-π堆积共组装成纳米颗粒（⁶⁸Ga/Gd-NPs）。这种共自组装策略不仅保留了细胞内自组装的核心优势，还带来了独特的益处：有序纳米结构的形成增加了钆（Gd）配合物的旋转相关时间（τ_R），从而增强了纵向弛豫率（r₁），改善了T₁加权MRI对比度；同时，⁶⁸Ga和Gd³⁺在同一个CBT-PSMA支架的DOTA基序中分别螯合，简化了生产流程，克服了剂量不匹配的挑战，并实现了放射性核素与造影剂比例的灵活按需调整。

结果与讨论

探针的合成与表征

Gd-CBT-PSMA的合成过程及表征详见补充材料。为了研究还原剂触发的缩合和自组装过程，将Gd-CBT-PSMA（200 μM）与三(2-羧乙基)膦（TCEP, 2 mM）在磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）中于37°C孵育2小时。高效液相色谱（HPLC）和基质辅助激光解吸/电离质谱（MALDI/MS）分析证实了Gd-CBT-PSMA的完全还原以及随后Gd-CBT二聚体的形成。透射电子显微镜（TEM）显示，这些二聚体通过非共价π-π堆积自组装成平均直径为143.2 ± 37.9 nm的纳米颗粒（Gd-NPs）。动态光散射（DLS）进一步支持了自组装过程，表明经TCEP处理后，流体动力学直径从4.69 ± 1.55 nm增加到172.90 ± 5.15 nm。

弛豫率与稳定性评估

使用3.0 T混合PET/MRI扫描仪测量弛豫率。商用Gd-DTPA、Gd-CBT-PSMA和Gd-NPs（Gd-CBT-PSMA与TCEP孵育后）的纵向弛豫率（r₁）值分别为4.89、5.55和7.67 mM^-1s^-1，表明TCEP诱导的自组装使r₁相对于Gd-CBT-PSMA提高了1.38倍。相应地，Gd-NPs的T₁值（258.46 ms）显著短于Gd-CBT-PSMA（507.13 ms）和Gd-DTPA（661.95 ms）。而横向弛豫率（r₂）和T₂值在各样品间无显著差异。这些结果确立了Gd-CBT-PSMA作为一种有效的、还原响应的T₁造影剂。体外稳定性评估显示，Gd-CBT-PSMA在0.9% NaCl和10%胎牛血清（FBS）中于37°C孵育48小时后，超过95%的化合物保持完整，表现出良好的生物稳定性。

体外细胞研究

MTT实验证实了Gd-CBT-PSMA在22Rv1细胞中具有良好的生物相容性。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析显示，在15至180分钟的孵育期间，Gd-CBT-PSMA在PSMA高表达的22Rv1细胞中的摄取量显著高于PSMA低表达的PC3细胞。与阻断组（细胞预先用无金属离子的CBT-PSMA孵育0.5小时）和商用造影剂Gd-DTPA相比，Gd-CBT-PSMA也表现出显著更高的细胞摄取率，这表明PSMA介导的内化和GSH诱导的细胞内自组装共同增强了探针在肿瘤细胞中的积累。

体外细胞MRI成像

为了进行T₁w和T₂w MR体模成像，将22Rv1细胞样本分为三组：实验组（与100 μM Gd-CBT-PSMA孵育2小时）、阻断组（预先用1 mM CBT-PSMA处理0.5小时，然后与100 μM Gd-CBT-PSMA孵育2小时）和对照组（与100 μM Gd-DTPA孵育2小时）。ICP-MS定量分析Gd浓度后，结果显示，Gd-CBT-PSMA组的r₁值（2.87 mM^-1s^-1）高于阻断组（1.22 mM^-1s^-1）和Gd-DTPA组（1.51 mM^-1s^-1）。相应地，Gd-CBT-PSMA组的T₁值（1839.63 ms）显著短于阻断组（2480.10 ms）和Gd-DTPA组（2324.06 ms）。而T₂w成像在各样品间未观察到显著差异。这些结果与弛豫率数据一致，证实了Gd-CBT-PSMA在PSMA过表达细胞中具有增强的T₁对比度。

体内PET/MRI混合成像

在22Rv1荷瘤NZG小鼠上进行时间序列冠状位PET/MRI成像。药代动力学研究显示，Gd-CBT-PSMA在静脉注射后的消除半衰期（T_1/2z）为41.3分钟，表明其能从血液中快速清除，具有较低的毒性潜力。使用不能发生谷胱甘肽触发缩合和纳米颗粒形成的对照化合物Gd-1-PSMA进行对比。结果显示，PSMA靶向共组装组（注射3.7 MBq ⁶⁸Ga-CBT-PSMA和6.5 mg/kg Gd-CBT-PSMA）在前列腺癌部位表现出显著增强的T₁和PET信号。而对照组（共同注射3.7 MBq ⁶⁸Ga-CBT-PSMA和6.5 mg/kg Gd-1-PSMA）则显示出极弱的PET/MRI信号。这种差异源于Gd-1-PSMA无法与⁶⁸Ga-CBT-PSMA共组装，并且可能部分阻断PSMA结合，从而降低了PET信号。相反，⁶⁸Ga-CBT-PSMA和Gd-CBT-PSMA的共同注射起到了佐剂作用，促进了低剂量PET示踪剂的组装，从而抵消了Gd-CBT-PSMA潜在的PSMA阻断效应。

定量分析与生物分布

肿瘤T₁值和肿瘤与肌肉（T/M）比值的定量分析表明，Gd-NPs的原位自组装显著增强了肿瘤部位的T₁w信号，信号强度在注射后约60分钟达到峰值，并在120分钟时仍可检测到。在共组装组中，PET的T/M和肿瘤与肝脏（T/L）比值在注射后30分钟达到峰值，早于MRI的峰值，这归因于放射性示踪剂的短半衰期。这些比值在所有时间点均显著高于共同注射⁶⁸Ga-CBT-PSMA和Gd-1-PSMA的小鼠。离体生物分布研究显示，在22Rv1荷瘤小鼠的三个组中，肾脏的放射性始终最高，表明主要通过肾脏排泄。值得注意的是，在注射后30分钟，Gd-CBT-PSMA共同注射组的肿瘤放射性显著高于其他器官（肾脏除外）以及Gd-1-PSMA共同注射组的肿瘤，进一步证实了共组装策略实现了肿瘤选择性积累。此外，注射后3小时收集的主要器官和肿瘤组织的组织病理学检查（H&E染色）未发现明显的病理异常，表明⁶⁸Ga-CBT-PSMA和Gd-CBT-PSMA具有良好的生物相容性和极低的急性毒性。

结论

本研究成功开发了一种PSMA靶向的小分子平台⁶⁸Ga/Gd-CBT-PSMA，用于同时增强前列腺癌成像中的MRI和PET信号。通过PSMA介导的内化和GSH诱导的共自组装，形成的⁶⁸Ga/Gd-NPs确保了双模态探针的长期滞留和局部浓度增加，并增加了Gd配合物的τ_R，最终实现了前列腺癌部位PET和MRI信号的同时增强。体外实验证实了Gd-NPs的形成及其对r₁值的显著提升，细胞实验证明了其对PSMA的选择性。体内PET/MRI混合成像结果显示，共同施用⁶⁸Ga-CBT-PSMA和Gd-CBT-PSMA增强了肿瘤部位的T₁w和PET信号，而用不能自组装的Gd-1-PSMA替代时信号微弱。因此，该平台利用PSMA和GSH共同构建的自组装策略，实现了前列腺癌的特异性和增强型PET/MRI混合成像，并为个体化患者和不同疾病类型提供了灵活、按需调整放射性核素与造影剂比例的方法。

实验部分

材料与仪器

除非另有说明，所有试剂均为市售分析纯或更高纯度。超纯水（18.2 MΩ·cm）用于所有实验。MALDI/MS谱图使用Bruker Daltonics Atouflex Speed飞行时间质谱仪记录。动态光散射（DLS）使用Malvern Zetasizer Nano ZS进行。HPLC分析使用Agilent 1260系统，配备G1322A泵和在线二极管阵列UV检测器，采用Agilent Zorbax 300SB-C18反相柱，以CH₃CN（0.1% TFA）和H₂O（0.1% TFA）为流动相。TEM图像在120 kV下运行的JEM-2100F场发射透射电子显微镜上采集。PET/MR成像在3.0 T GE SIGNA PET/MR系统上进行。

细胞培养

22Rv1和PC3人前列腺癌细胞在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中，于37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。

MTT实验

通过MTT实验评估Gd-CBT-PSMA对22Rv1细胞的细胞毒性。将对数生长期的细胞接种于96孔板（5 × 10³个细胞/孔），培养过夜。然后将培养基更换为含有不同浓度（6.25、12.5、25、50和100 μM）Gd-CBT-PSMA的100 μL溶液（含0.4% DMSO）。在37°C孵育12或24小时后，向每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL in PBS），再孵育4小时。弃去上清液后，将形成的甲臜晶体溶解于100 μL DMSO中。使用VARIOSKAN FLASH酶标仪在490 nm处测量每孔的吸光度。细胞存活率计算公式为：（处理组平均吸光度/对照组平均吸光度）× 100%。

细胞摄取研究

将22Rv1和PC3细胞与100 μM Gd-CBT-PSMA孵育15、30、60、90、120和180分钟后，用PBS洗涤三次，细胞在浓HNO₃中裂解，通过ICP-MS测定Gd含量。对于阻断实验，22Rv1细胞首先用1 mM CBT-PSMA处理30分钟，然后与100 μM Gd-CBT-PSMA共处理60分钟。

用于MRI的细胞样本制备

将22Rv1细胞分为三组：Gd-CBT-PSMA组（细胞在无血清培养基中与100 μM Gd-CBT-PSMA孵育2小时）、阻断+Gd-CBT-PSMA组（细胞预先用1 mM CBT-PSMA处理30分钟，然后在无血清培养基中与100 μM Gd-CBT-PSMA孵育2小时）和Gd-DTPA组（细胞在无血清培养基中与100 μM Gd-DTPA孵育2小时）。所有组在孵育造影剂后均用PBS洗涤三次，稀释至四个浓度，并重悬于含0.5 wt%琼脂糖凝胶的无血清培养基中。

3.0 T体外和体内MRI实验

体外实验的MR成像在3.0 T MR系统上进行，使用2D快速自旋回波多动态、多回波（MDME）序列，参数为：TR = 4641 ms, TE1 = 14.4 ms, TE2 = 104.9 ms, 层厚 = 2.0 mm, 视野（FOV）= 12 cm, 采集矩阵 = 160 × 160。MDME数据使用供应商提供的MAGiC软件进行弛豫率分析。体内小鼠成像使用冠状位T₁w快速自旋回波序列，参数为：TR = 594 ms, TE = 9 ms, 层厚 = 2.0 mm, FOV = 12 cm, 采集矩阵 = 160 × 160。

动物肿瘤模型

动物护理遵循安徽医科大学实验动物科学协会和实验动物科学中心的指导原则，并经机构动物护理和使用委员会批准。通过将1 × 10⁷个22Rv1细胞（200 μL, 1:1 细胞: Matrigel）皮下注射到雄性NZG小鼠（5周龄）的右肩部，建立用于PET/MR成像的22Rv1荷瘤模型。

体内药代动力学研究

在KM小鼠中评估Gd-CBT-PSMA的药代动力学特征。静脉注射（6.5 mg/kg）后，通过眼眶后采血获取系列时间点的血液样本。称重和裂解后，通过ICP-MS定量每个样本中的Gd浓度，并使用GraphPad Prism 10.1.2分析数据。

统计分析

数据表示为三个独立实验的平均值±标准差（SD）。两组间的差异通过双尾Student's t检验进行评估；多组间的比较使用单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett事后检验。统计学显著性设定为P < 0.05。使用GraphPad Prism 10.1.2进行分析。