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本文开发了基态黄素依赖酶催化的对映选择性自由基三氟甲基化策略，利用两种工程化酶催化相关反应，为生物催化与有机氟化学架起桥梁，为解决立体选择性氟烷基化难题提供新方案，助力含氟药物研发。
引言
在药物研发中，氟烷基尤其是三氟甲基（CF3）基团的引入，可提升药物分子的亲脂性、生物利用度、结合选择性及代谢稳定性，对治疗效果意义重大。构建含 CF3的有机氟化物成为化学研究热点，其中 C (sp2)–CF3键的合成已取得显著进展，但光学纯 C (sp3)–CF3化合物的合成相对受限。
目前，CF3取代底物的对映选择性合成主要有两种策略：一是前手性 CF3取代底物的不对称官能化，需合成含氟构建块的前体；二是直接将 CF3基团对映选择性地安装到前手性底物上，不过立体化学控制难度较大。
生物催化在对映选择性合成中发挥着日益重要的作用，但含氟天然产物稀缺，导致有机氟化学与生物催化之间存在差距。目前仅发现一种能形成 C–F 键的天然酶（S - 腺苷甲硫氨酸依赖型），且尚未发现天然的含 CF3化合物，寻找可催化 C–CF3键形成的天然酶困难重重。尽管研究人员开发了多种方法将含氟底物引入复杂功能分子，但利用生物催化策略直接将 CF3基团对映选择性地安装到前手性底物上的实例仍较少。
激发态介导的生物催化，特别是涉及黄素依赖酶的反应，成为开发新反应的重要策略，可通过酶辅因子或光催化剂产生自由基，利用酶口袋精确控制立体选择性。然而，预测黄素与底物形成的电子供体 - 受体（EDA）复合物困难，且可见光照射下含黄素辅因子易降解，影响光酶催化效率。利用基态电子转移引发反应为光酶催化提供了新途径，该方法依赖黄素氢醌（FMNhq）的还原能力，无需光照激活，但目前仅用于生成 α - 羰基碳中心自由基。本研究旨在寻找能促进黄素依赖酶基态电子转移的试剂，实现对映选择性自由基三氟甲基化反应。同时，CF3自由基的高亲电性使其易被电子淬灭，限制了其被其他自由基受体捕获，这也是研究面临的挑战之一。
结果
对映选择性氢三氟甲基化
研究人员以 α - 甲基苯乙烯（1a）和 CF3自由基供体为底物，在 1 mol% 黄素依赖酶存在下进行对映选择性氢三氟甲基化反应研究。考虑到基态 FMNhq的单电子还原能力有限，评估了典型 CF3自由基供体的还原电位，并同时筛选黄素依赖酶和 CF3自由基供体。结果表明，以三氟甲基磺酰苯（CF3–1）为 CF3自由基供体时，目标产物收率较低；托格尼试剂 I（CF3–3）的效果优于托格尼试剂 II（CF3–2）；二苯基（三氟甲基）锍三氟甲磺酸盐（CF3–4）与酿酒酵母老黄色酶 1（OYE1）反应，可得到（S） - 2a，收率 60%，对映体比例（e.r.）为 94:6；三氟甲基噻蒽三氟甲磺酸盐（TT–CF3+OTf–，CF3-5）与 OYE1 组合效果最佳，（S） - 2a 收率 72%，e.r. 为 94:6。降低酶浓度至 0.1 mol%，收率仍可达 50%。对照实验验证了 OYE1 和 NADPH 循环系统在反应中的关键作用，游离黄素单核苷酸（FMN，1 mol%）参与反应时，氢三氟甲基化仅能以消旋体形式得到 8% 的收率，表明蛋白质支架至关重要。额外光照会使收率略有下降，可能是 FMN 光降解所致。
为提高 OYE1 的催化效率，对其活性位点靠近黄素辅因子的残基（Tyr82、Asn194、Tyr196、Phe250、Asn251、Phe 296、Tyr375）进行突变筛选。多数突变体的对映选择性下降，而 N251M 突变体表现出色，该酶催化氢三氟甲基化反应的收率为 81%，e.r. 为 98:2，总周转数（TTN）达 550。
对映选择性三氟甲基 - 烷基交叉亲电偶联
受上述结果启发，研究人员尝试将该策略应用于以硝基烷烃为自由基受体的三氟甲基 - 烷基交叉亲电偶联反应。在碱性条件下，硝基烷烃生成硝酮捕获自由基，自由基加成过程中硝基消除，有利于构建含 CF3取代手性碳的 C (sp3)–CF3键。以 CF3–5 和 1 - 甲氧基 - 4 - （1 - 硝基乙基）苯（3a）在 pH = 9.0 的 Tris 缓冲液中，用 OYE1 催化反应，效率较低，目标产物收率 20%，e.r. 为 62:38。进一步筛选一系列黄素依赖酶，发现酿酒酵母老黄色酶 3（OYE3）和葡萄糖氧化杆菌烯酸还原酶（GluER）表现较好。OYE3 催化得到产物（S） - 5a，收率 40%，e.r. 为 74:26；GluER 的收率更高，为 60%，但对映选择性中等（e.r. 为 69:31）。综合考虑收率和立体选择性，选择 GluER 为模板进行进一步工程改造。对其活性位点残基突变筛选后，Y177F 突变体的对映选择性提高至 95:5，收率 71%。降低酶浓度至 0.1 mol%，收率为 30%，e.r. 值不变，Y177F 变体的 TTN 为 320。研究还发现，较低 pH 值下反应收率下降，是因为此时形成硝酮 4a 的难度增加。对照实验证实酶支架和 NADPH 循环系统对该反应至关重要。
底物范围
获得最佳突变体后，研究人员考察了这些立体选择性三氟甲基化反应的底物范围。对于氢三氟甲基化反应，多数测试的苯乙烯衍生物作为自由基受体，在标准反应条件下均能兼容，可得到相应产物，收率适中至优异，对映选择性良好，展现出该反应良好的官能团耐受性。苯环邻、间、对位带有供电子或吸电子基团的苯乙烯均可顺利反应，收率高达 98%，e.r. 值达 99:1；杂环底物也能得到目标产物（S） - 2i，但对映选择性较低（e.r. 为 82:18），利用文库中的 F296A 突变体可改善结果（收率 80%，e.r. 为 92:8）；二取代衍生物底物同样适用（2j，收率 68%，e.r. 为 97:3）。相比之下，α - 苯基和乙基苯乙烯的活性显著降低，且苯基（2k）生成的产物收率高于乙基，可能是空间位阻和苯环供电子性质共同作用的结果。考虑到延长全氟烷基链在药物化合物中的重要性，将反应扩展至全氟丁基化，带有供电子或吸电子基团的苯乙烯可高效引入全氟丁基，收率高且立体选择性优异。该反应还可放大至 20 mg（0.2 mmol 1a），收率 70%（分离收率 51%，产物挥发性高），且立体选择性无损失。
在三氟甲基 - 烷基交叉亲电偶联反应中，α - 芳基硝基烷烃的苯基上带有供电子取代基（如甲氧基、甲基）和吸电子取代基（如乙氧羰基、卤素）均能兼容。苯基上带有供电子和吸电子基团的硝基烷烃收率无显著差异，体现了该过程的兼容性。受空间位阻影响，（1 - 硝基丙基）苯无法反应，而大体积萘基底物反应可得 27% 收率，e.r. 为 97:3。以 3a（0.2 mmol）进行放大实验，可得目标产物（S） - 5a，收率 62%（分离收率 44%），e.r. 为 95:5。
机理研究
为探究反应机理，进行了紫外 - 可见光谱实验。TT–CF3+OTf–（CF3–5）和含黄素氢醌（FMNhq）的 OYE1–N251M 酶溶液在可见光光谱中均无明显吸收。向酶溶液中加入 CF3–5 后，在 400 - 450 nm 范围内出现轻微吸收带，延长时间 10 分钟后，该范围内出现明显氧化峰，表明基态 FMNhq被 CF3–5 氧化。GluER - Y177F 也得到类似结果。
在自由基捕获实验中，分别使用 2,2 - 二烯丙基丙二酸二乙酯和 2,2,6,6 - 四甲基哌啶氮氧化物（TEMPO）作为自由基受体，生成的加合物证实了三氟甲基自由基的形成。
通过同位素掺入实验研究自由基终止机制。在氘代缓冲液中使用 NADPH / 葡萄糖系统进行模型反应，产物 3a 和 5a 中氘掺入水平较低；而使用氘代葡萄糖生成氘代黄素半醌（FMNsq）时，产物的氘掺入率显著提高，表明反应倾向于通过 FMNsq的氢原子转移（HAT）终止。
基于上述实验，提出反应机理：TT–CF3+OTf–通过 FMNhq的基态电子转移生成 CF3自由基，CF3自由基被自由基受体捕获，最终产物通过 FMNsq的立体选择性淬灭形成。
量子力学 / 分子力学（QM/MM）计算证实了氢三氟甲基化和三氟甲基 - 烷基交叉亲电偶联反应在能量上的可行性，表明这两个反应在热力学上有利，动力学上可行。
通过分子动力学模拟研究反应性和立体选择性的起源。OYE1 的 N251M 突变和 GluER 的 Y177F 突变改变了底物结合口袋的结构，缩短了 FMNsq与产物自由基中间体之间的淬灭距离。分子力学 / 广义 Born 表面积（MM/GBSA）计算得到的结合能显示，N251M 与野生型 OYE1 相比，对自由基中间体的结合亲和力略有增加，而 WT - GluER 和 Y177F GluER 的结合自由能比较时，这种趋势更为明显。结合自由能的残基分解表明，OYE1 的 N251M 突变使 F374 的贡献增加，GluER 的 Y177F 突变使 R261 和噻蒽三氟甲磺酸盐（TT）的贡献显著增加。在对映选择性分析中，测量产物自由基中间体 2a/5a 的共面碳原子与 FMNsq的 N5 位氢原子形成的二面角，分子动力学模拟中二面角的变化表明，MD 重现了 Y177F 相对于 WT - GluER 提高的对映选择性，并证实 N215M 使 OYE1 保持了选择性。
讨论
本研究开发了黄素依赖酶催化的立体选择性三氟甲基化反应，包括氢三氟甲基化和三氟甲基 - 烷基交叉亲电反应，获得了重要的手性氟烷基结构单元。该生物催化方法使用易得的 CF3试剂，实现了将 CF3基团直接对映选择性地引入前手性底物。利用基态 FMNhq催化电子转移，无需光照即可生成 CF3自由基。两种工程化酶可有效捕获高活性 CF3自由基，并精确控制对映选择性。该方法为生物催化与有机氟化学搭建了桥梁，为解决有机合成中具有挑战性的立体选择性氟烷基化反应提供了新策略。
方法
黄素依赖酶催化的立体选择性三氟甲基化反应通用步骤
在含有磁搅拌棒的 10 mL Schlenk 管中加入 960 μL 酶溶液（0.025 - 0.05 μmol 纯酶，氢三氟甲基化反应使用 pH = 8.0 的 Tris 缓冲液，三氟甲基 - 烷基交叉亲电偶联反应使用 pH = 9.0 的 Tris 缓冲液），其中包含 NADP+（0.5 μmol）、葡萄糖脱氢酶（GDH，0.1 mg，约 3U）和葡萄糖（100 μmol）。随后加入 40 μL 含有苯乙烯 1 或硝基烷烃 3（5 μmol）以及 TT–CF3+OTf?或 TT–C4F9+OSO2C4F9?（10 μmol）的二甲基亚砜（DMSO）储备液。在氮气氛围下，通过冷冻 - 抽真空 - 解冻循环对混合物进行三次除气。反应在室温下搅拌 12 h，然后用乙酸乙酯萃取三次。通过气相色谱（GC）或高效液相色谱（HPLC）测定收率和对映选择性。
报告总结
有关研究设计的更多信息可在与本文相关的《自然组合报告总结》中获取。
