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Toll 样受体 3（TLR3）作为免疫调节的关键靶点，其激动剂在疫苗佐剂开发中极具潜力。然而，现有核酸类 TLR3 激动剂存在诸多问题。研究人员通过计算蛋白设计开展相关研究，成功获得纳米摩尔亲和力的 TLR3 微结合蛋白，且多价形式可激活 NF-κB 信号通路，为开发新型疫苗佐剂奠定基础。
在人体的免疫系统中， Toll 样受体（TLRs）家族就像是一群警惕的 “哨兵”，时刻守护着身体的健康防线。其中，Toll 样受体 3（TLR3）尤为特殊，它能识别病毒的双链 RNA（dsRNA），进而启动抗病毒免疫反应，在激活先天免疫系统方面发挥着关键作用，这也让它成为疫苗佐剂开发的理想靶点。疫苗佐剂就像是疫苗的 “好帮手”，添加到疫苗中可以增强适应性免疫反应，提高疫苗的效果 。
尽管目前已经有一些新型佐剂被开发出来，像 TLR4 激动剂的解毒衍生物单磷酰脂质 A（MPLA）和 TLR9 激动剂 CpG，它们分别被用于一些已获批的疫苗中。但不可忽视的是，佐剂的开发常常会遇到各种难题，比如知识产权问题、安全性考量以及制剂困难等。而 TLR3 的激动剂开发更是面临着独特的挑战，现有的 dsRNA 作为激动剂，稳定性差、结构多样，还会激活其他免疫受体，容易导致免疫过度刺激和自身免疫问题。因此，开发一种化学性质明确、稳定且易于制剂的 TLR3 特异性激动剂迫在眉睫。
为了解决这些问题，来自美国华盛顿大学蛋白质设计研究所（Institute for Protein Design, University of Washington）和韩国基础科学研究所（Center for Biomolecular & Cellular Structure, Institute for Basic Science, IBS）等机构的研究人员展开了深入研究。他们利用计算蛋白设计技术，成功创造出了能与人类 TLR3 紧密结合的新型微蛋白，这些微蛋白对 TLR3 具有纳摩尔级别的亲和力。并且，研究发现这些微蛋白的多价形式能够诱导表达 TLR3 的细胞系中的 NF-κB 信号传导，这表明它们可能具有治疗相关的生物活性。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为开发特异性强、稳定且易于制剂的基于蛋白质的 TLR 和其他模式识别受体激动剂奠定了坚实基础。
研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。计算蛋白设计方面，借助 Rosetta RifDock 等工具，从大量候选设计中筛选潜在的微结合蛋白。酵母表面展示技术则用于筛选与 TLR3 结合的微蛋白，通过荧光激活细胞分选（FACS）来识别结合细胞。生物膜干涉技术（BLI）被用于测定微蛋白与 TLR3 的结合亲和力。冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了微蛋白与 TLR3 复合物的结构，让研究人员得以从原子层面了解它们的相互作用机制 。
下面来看具体的研究结果：
- 计算设计 TLR3 微结合蛋白：研究人员依据 TLR3 的结构特点，在其表面挑选了两个位点 A 和 B 用于微结合蛋白的设计。运用 Rosetta RifDock 管道，设计出大量候选微结合蛋白，经过多轮筛选，最终确定了 23,789 个设计用于实验表征。通过酵母表面展示和 FACS 筛选，成功得到 11 个与 TLR3 结合的微蛋白，筛选成功率与以往研究相符。
- TLR3 微结合蛋白的生化表征：经筛选得到的 11 个微蛋白均靶向位点 A，推测位点 B 因靠近 N - 连接聚糖而阻碍了结合。对这些微蛋白进行表达、纯化和亲和力测定，其中 6 个微蛋白与 hTLR3 的结合亲和力在 43 - 1500 nM 之间。通过位点饱和诱变（SSM）进一步优化，获得了亲和力更强的变体，如微蛋白 7.1 和 8.6，它们的 KD 值分别低至 48 nM 和 37 nM 。
- 微结合蛋白 - TLR3 复合物的结构表征：选择微蛋白 7.7 和 8.6 进行结构研究，利用冷冻电镜技术解析了它们与 TLR3 复合物的结构，分辨率达到 2.9 ?。结构显示，微蛋白 7.7 的 α3 螺旋因与 N413 聚糖的空间冲突而部分无序，而微蛋白 8.6 则保持稳定的 3 - 螺旋束结构。两者与 TLR3 的结合方式略有不同，且均通过疏水和静电相互作用与 TLR3 结合。
- 多价微结合蛋白激活 TLR3：研究人员构建了不同多价形式的微蛋白，如串联融合的二价、四价和六价微蛋白，以及与反平行卷曲螺旋融合的二聚体微蛋白。实验表明，多价微蛋白能够诱导 TLR3 多聚化，其中四价 7.1 和 8.6 二聚体可诱导剂量依赖性的 NF-κB 激活，且四价 8.6 激活 TLR3 的效率更高，与已知激动剂 poly（I:C）效果相当 。
研究结论和讨论部分指出，该研究成功运用计算蛋白设计创造出稳定的 TLR3 蛋白激动剂。微蛋白 7.7 与 TLR3 结合时，其三螺旋的无序现象为设计微结合蛋白提供了新的思路，或许可利用与聚糖的空间竞争机制引入开关行为。多价微蛋白虽能激活 NF-κB 信号通路，但要成为真正可用的蛋白质类佐剂，还需进一步研究如何使其在体内精准到达表达受体的细胞内体。同时，调整微蛋白的多聚化形式，使其与 TLR3 完全激活的信号复合物几何结构相匹配，可能会进一步提升其活性。将该研究的设计方法与新兴的多聚体支架设计方法相结合，有望成为设计基于蛋白质的 TLR 激动剂的有力策略，为未来疫苗佐剂的开发开辟新方向 。
