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放疗是胶质母细胞瘤(GBM)治疗的重要组成部分,但患者的预后往往受到耐药性的限制。在这里,作者确定了IFI16在促进细胞衰老样表型,抑制铁凋亡和驱动放射耐药中的作用,这可以在临床前GBM模型中用格列本脲克服。
靶向 IFI16 蛋白:胶质母细胞瘤放疗增敏新策略
复旦大学上海医学院放射医学研究所的研究人员联合广东三九脑科医院、上海科技大学等机构,在《Nature Communications》期刊发表了题为 “Cellular senescence-associated gene IFI16 promotes HMOX1-dependent evasion of ferroptosis and radioresistance in glioblastoma” 的论文。该研究揭示了胶质母细胞瘤(GBM)放疗抵抗的关键机制,并发现了潜在的治疗靶点,为改善 GBM 患者的治疗效果提供了新的方向 。
论文的第一作者为周玉川、曾亮、蔡林波,通讯作者为潘艳、张姜红和邵春林。研究团队通过构建放疗抵抗的 GBM 细胞模型,综合运用基因组和转录组分析等多种技术,深入探究了 GBM 放疗抵抗的分子机制,为 GBM 的治疗开辟了新思路。
一、研究背景
GBM 是一种恶性程度极高的脑肿瘤,5 年生存率仅 7.2%。尽管手术、放疗和化疗等治疗手段不断发展,但 GBM 极易复发,这主要归因于其细胞异质性和治疗过程中的细胞进化 。近年来的研究表明,胶质瘤在治疗过程中存在从新生肿瘤向老化肿瘤转变的趋势,提示 GBM 治疗过程中可能存在细胞衰老现象。
传统观点认为,细胞衰老具有抗肿瘤作用,但越来越多的证据显示,放疗和化疗会导致肿瘤中衰老细胞积累,这些衰老肿瘤细胞可通过衰老相关分泌表型(SASP)促进肿瘤复发、转移和耐药 。γ 干扰素诱导蛋白 16(IFI16)作为细胞内 DNA 的先天免疫传感器,参与细胞衰老过程,但它在肿瘤发展中的具体机制尚不清楚 。此外,铁死亡是一种新发现的程序性细胞死亡方式,在 GBM 中高度富集 。血红素加氧酶 - 1(HMOX1)在 GBM 中的作用存在争议,其与铁死亡的关系也有待明确。
二、研究材料和方法
(一)细胞培养与照射
研究使用了 GBM 细胞系 U251 和 Ln229,通过每天给予 2 Gy X 射线照射,共照射 30 次,总剂量达 60 Gy,构建了放疗抵抗细胞系 U251R 和 Ln229R 。为维持其放疗抵抗表型,每 4 周对这些细胞进行额外 6 Gy 的 X 射线照射。细胞培养在含有 10% 胎牛血清、100 单位 /ml 青霉素和 100 mg/ml 链霉素的 DMEM 培养基中,置于 37°C、5% CO?的培养箱中培养,并定期检测支原体污染 。
(二)实验方法
研究采用了多种实验方法,包括集落形成实验评估细胞放射敏感性;蛋白质免疫印迹法检测蛋白表达水平;β - 半乳糖苷酶染色检测细胞衰老;RNA 提取和 RT - qPCR 分析基因表达;免疫荧光染色观察细胞内蛋白定位和表达;RNA 测序和 ATAC 测序分析基因表达谱和染色质可及性;构建敲低和过表达细胞系研究基因功能;药物处理诱导细胞衰老或干预铁死亡等过程;使用数据库挖掘临床数据;建立异种移植肿瘤小鼠模型进行体内实验;采用多种检测方法评估细胞增殖、脂质过氧化、活性氧(ROS)和细胞内 Fe2?含量等指标 。
(三)关键技术路线
首先构建放疗抵抗的 GBM 细胞模型,通过对模型细胞和对照细胞进行多组学分析,筛选出与放疗抵抗和细胞衰老相关的关键基因 IFI16 。接着研究 IFI16 对 GBM 细胞放射敏感性和铁死亡的影响,探究其作用机制,即 IFI16 通过与转录因子 JUND 和 SP1 相互作用,调节 HMOX1 的表达,进而抑制铁死亡 。最后,研究团队发现降糖药格列本脲可通过结合 IFI16 的 pyrin 结构域,增强 GBM 细胞的放疗敏感性和铁死亡,为 GBM 的治疗提供了潜在的新策略 。
三、研究结果
(一)放疗抵抗的 GBM 细胞呈现细胞衰老样表型
研究人员构建的 U251R 和 Ln229R 细胞系相较于其亲本细胞系,对辐射的敏感性增强比(SER)分别为 0.64 和 0.67 。这些放疗抵抗细胞表现出异染色质重组,HP1 表达增加,H3K27ac 水平降低;细胞周期蛋白 p21 和 p16 上调;细胞形态拉长,长宽比增加;β - 半乳糖苷酶活性升高;SASP 因子如 CCL5、IL - 6、MMP - 9 和 IFN - β 分泌增加;Ki67 阳性区域减少,增殖能力降低 。基因集富集分析(GSEA)和基因本体(GO)分析表明,放疗抵抗的 GBM 细胞中免疫系统过程显著上调 。
(二)IFI16 促进 GBM 细胞的细胞衰老样表型
通过 ATAC 测序和 RNA 测序分析,研究人员发现 IFI16 是调节 GBM 细胞衰老样表型的关键基因 。在放疗抵抗的 GBM 细胞中,IFI16 表达上调,且与 SASP 相关通路有关 。敲低 IFI16 后,免疫相关通路下调,β - 半乳糖苷酶活性降低,HP1、p21 和 p16 表达减少,H3K27ac 水平升高,Ki67 阳性细胞增多,SASP 相关炎症因子显著下调 。而过表达 IFI16 则产生相反的结果,进一步证实 IFI16 在促进 GBM 细胞衰老样表型中的关键作用 。
(三)IFI16 通过抑制铁死亡促进 GBM 细胞的放疗抵抗
利用临床数据库分析发现,IFI16 高表达与 GBM 患者预后不良相关,且在复发性 GBM 中 IFI16 表达上调,其表达水平随 GBM 分级升高而增加 。集落形成实验和体内实验表明,敲低 IFI16 可增加 U251R 和 Ln229R 细胞的放射敏感性,抑制异种移植肿瘤生长;过表达 IFI16 则使 U251 和 Ln229 细胞产生放疗抵抗 。通过使用不同的细胞死亡抑制剂处理 IFI16 敲低细胞,发现铁死亡抑制剂 Fer - 1 和铁螯合剂 DFO 可挽救照射后的生长抑制,表明 IFI16 敲低细胞的放射增敏可能与铁死亡增加有关 。进一步研究发现,IFI16 敲低导致 GPX4 表达降低,脂质过氧化、ROS 和细胞内 Fe2?水平升高;而过表达 IFI16 则减少这些指标的水平,增加 GPX4 表达 。
(四)IFI16 以 HMOX1 依赖的方式抑制铁死亡
整合 RNA 测序和 FerrDb 铁死亡数据库分析,研究人员发现 HMOX1 是 IFI16 调节铁死亡的关键基因 。HMOX1 在放疗抵抗的 GBM 细胞中高表达,其高表达与患者预后不良相关,且在复发性 GBM 中上调,随 GBM 分级升高而增加 。敲低 HMOX1 可增加 GBM 细胞的放射敏感性,降低 GPX4 表达,增加脂质过氧化、ROS 和细胞内 Fe2?水平;过表达 HMOX1 则相反 。此外,过表达 HMOX1 可部分逆转 IFI16 敲低导致的 GPX4 水平下降,减少脂质过氧化、ROS 和细胞内 Fe2?含量的增加,有效抵消 IFI16 敲低引起的放射敏感性增加,表明 IFI16 通过诱导 HMOX1 表达来减少照射后 GBM 细胞的铁死亡 。
(五)IFI16 通过与 JUND 和 SP1 相互作用促进 HMOX1 表达
由于 IFI16 主要定位于细胞核,研究人员推测其通过特定转录因子调节 HMOX1 表达 。通过对 ATAC 测序数据进行基序分析,发现 JUND 结合基序位于 HMOX1 启动子区域 。进一步研究发现,放疗抵抗的 GBM 细胞中 JUND 和 H3K27ac 在 JUND 结合位点(p1 区域)水平较高,而 SP1 和 HDAC1 在 SP1 结合位点(p2 区域)水平较低且 H3K27ac 增加 。敲低 IFI16 会降低 p1 区域的 JUND 信号,增加 p2 区域的 SP1 和 HDAC1 信号,同时降低两个区域的 H3K27ac 水平;过表达 IFI16 则产生相反的效果 。
荧光素酶报告基因实验表明,JUND 激活 HMOX1 启动子荧光素酶报告基因,SP1 则抑制其活性,而 IFI16 可抵消 SP1 的抑制作用 。在 U251 和 Ln229 细胞中过表达 IFI16、JUND 和 SP1 的实验进一步证实,IFI16 可保护 JUND 的转录作用,对抗 SP1 的抑制作用,最终促进 HMOX1 表达 。
(六)IFI16 通过其 pyrin 结构域与 JUND 相互作用
通过免疫共沉淀实验,研究人员证实 IFI16 与 JUND 在 GBM 细胞中存在直接相互作用,且这种结合不依赖于 DNA 。将 IFI16 蛋白分为五个结构域构建截断质粒,发现只有代表 pyrin 结构域的截断质粒 a 能与 JUND 相互作用 。同样,通过构建 JUND 的截断质粒,确定 IFI16 与 JUND 的 1 - 127 氨基酸区域相互作用 。刚性蛋白 - 蛋白对接模型显示,IFI16 与 JUND 的相互作用界面主要在 IFI16 的 pyrin 结构域和 JUND 的 1 - 127 氨基酸区域,二者可形成氢键,稳定相互作用 。
研究还发现,IFI16 的 pyrin 结构域突变(IFI16KL - AA)会导致其无法与 JUND 和 SP1 相互作用,且该突变体对 GBM 细胞的放疗抵抗和辐射诱导的铁死亡均无影响 。此外,在放疗抵抗的 GBM 细胞中,IFI16 - A 是主要的异构体,且 AIM2 的表达在不同处理的细胞中无显著变化 。
(七)格列本脲通过直接结合 IFI16 的 pyrin 结构域增强放疗敏感性和铁死亡
由于格列本脲可抑制含 pyrin 结构域的炎性小体激活,研究人员推测其可能调节 IFI16 的功能 。Autodock Vina 预测分析表明,格列本脲可与 IFI16 的 pyrin 结构域特定残基形成氢键 。药物亲和反应靶点稳定性(DARTS)实验证实,格列本脲能与 IFI16 的 pyrin 结构域特异性结合 。
功能实验发现,格列本脲处理可增加放疗抵抗 GBM 细胞的放疗敏感性,提高照射后脂质过氧化物、ROS 和细胞内 Fe2?水平,降低 GPX4 表达 。但在 IFI16 敲低的 GBM 细胞中,格列本脲无法增强放疗敏感性,对 GPX4 表达和相关指标也无影响 。体内实验表明,在原位 U251R 异种移植模型中,放疗联合格列本脲可显著延长小鼠生存期,减小肿瘤体积,且免疫组化分析显示,格列本脲处理可降低脑肿瘤中 IFI16、HMOX1 和 GPX4 的水平 。
四、研究结论与讨论
(一)研究结论
本研究通过构建放疗抵抗的 GBM 细胞模型,综合基因组和转录组分析,确定 IFI16 是 GBM 放疗抵抗的关键驱动基因 。IFI16 通过与转录因子 JUND 和 SP1 相互作用,促进 HMOX1 转录,抑制铁死亡,增强 GBM 细胞的放疗抵抗 。研究还发现,降糖药格列本脲可特异性结合 IFI16 的 pyrin 结构域,抑制 IFI16 活性,促进铁死亡,增强 GBM 细胞的放疗敏感性,为 GBM 的治疗提供了潜在的新策略 。
(二)讨论
辐射可诱导细胞衰老,本研究证实放疗抵抗的 GBM 细胞系相较于亲本细胞系呈现细胞衰老样表型 。IFI16 与 GBM 的不良预后和放疗抵抗相关,其作用机制不仅涉及细胞衰老,还与抑制铁死亡有关 。HMOX1 在铁死亡中的作用存在争议,但在本研究的放疗抵抗 GBM 细胞中,HMOX1 表现为铁死亡的抑制剂,这与 GBM 中血红素代谢受抑制的现象一致 。
此外,研究揭示了 IFI16 在转录调控中的新作用,即通过与 JUND 和 SP1 相互作用调节 HMOX1 表达 。IFI16、GPX4 和 HMOX1 可作为 GBM 放疗抵抗的潜在生物标志物,其水平升高可能与放疗后 GBM 复发有关 。
本研究也存在一定局限性,在原位模型中未能完全捕捉 IFI16、HMOX1 和 GPX4 在照射后的动态变化,这可能与物种特异性表达差异有关 。未来研究可使用人源化小鼠模型或患者来源的异种移植物,更精确地了解这些动态变化 。尽管如此,本研究仍为 GBM 放疗抵抗的机制提供了深入见解,为开发更有效的 GBM 治疗策略奠定了基础 。