单细胞RNA测序与批量转录组解卷积中转录组大小校正算法的开发与应用

针对单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据标准化和批量RNA-seq解卷积中因忽略转录组大小差异导致的基因表达偏差问题，Songjian Lu等开发了ReDeconv算法。该工具通过CLTS（基于线性化转录组大小的计数）标准化方法，有效校正了CP10K标准化导致的差异表达基因误识别，并整合表达方差信息提升了解卷积精度，尤其在稀有细胞类型分析中表现优异。研究为单细胞和批量转录组数据的整合分析提供了新标准，相关成果发表于《Nature Communications》。

　　

在生命科学研究中，单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术革命性地提升了我们对细胞异质性的认知，而批量RNA-seq则因其成本优势和临床样本兼容性仍不可替代。然而，两种技术的整合分析长期面临核心挑战：不同细胞类型的转录组大小（单个细胞内mRNA分子总数）存在显著差异，但现有scRNA-seq标准化方法（如CP10K）强制均一化处理，导致细胞类型间基因表达比较失真，进而影响差异表达基因(DEGs)识别和批量样本细胞组成解卷积的准确性。

针对这一瓶颈问题，研究人员开发了ReDeconv算法框架。该工具创新性地提出CLTS（Count based on Linearized Transcriptome Size）标准化方法，通过保留不同细胞类型间真实的转录组大小差异，同时消除技术批次效应，显著提升了scRNA-seq数据的生物学解释可靠性。研究团队通过跨物种（小鼠/人）、跨平台（10X Genomics/Illumina）和多组织（大脑/肿瘤/肺）数据验证，证实CLTS较传统CP10K标准化能更准确反映基因表达差异，尤其在神经元与星形胶质细胞的DEGs识别中，与空间转录组（CosMx）的吻合度从62.4%提升至86.7%。在批量RNA-seq解卷积应用中，ReDeconv通过同步解决基因长度效应（Type-II）和表达方差建模（Type-III）问题，对稀有细胞类型的比例预测误差降低50%以上，为肿瘤微环境(TME)研究等需要精确量化细胞组成的领域提供了新标准。

关键技术方法包括：1）基于Allen Institute小鼠/人脑单细胞图谱和肺癌scRNA-seq数据构建跨样本转录组大小线性校正模型；2）使用CosMx空间转录组作为金标准验证DEGs识别准确性；3）通过6种合成数据集（SYN Data A-F）和2种真实批量RNA-seq数据集（细胞系混合样本和PBMC分选样本）进行多维度基准测试；4）开发概率模型整合细胞类型特异性表达方差信息优化解卷积算法。

主要研究结果如下：

ReDeconv框架
提出三层次问题解决方案：Type-I（转录组大小差异）通过CLTS标准化校正，Type-II（基因长度效应）采用选择性TPM/RPKM标准化，Type-III（表达方差）通过稳定特征基因筛选优化。数学推导表明，CP10K标准化会使大转录组细胞类型的基因表达被压缩，小转录组细胞类型被放大，导致解卷积比例系统性偏差。

跨物种转录组大小保守性
分析55个小鼠样本和人类运动皮层数据发现，相同细胞类型的转录组大小在不同样本间呈强线性相关（R>0.95），且跨物种保守（小鼠L5神经元与人类L2/3神经元大小比例均为5:1）。技术批次效应表现为所有细胞转录组的等比例缩放，而CLTS能有效分离这种技术噪声与真实生物变异。

DEGs识别准确性提升
以Plcb1基因为例，CLTS标准化正确显示其在L5神经元的表达是星形胶质细胞的3.2倍，而CP10K标准化错误反转该比值至0.7倍。对107个CP10K特异性"下调基因"的验证显示，93.5%实际在CosMx数据中呈上调表达，证实CLTS可减少76%的假阳性DEGs。

合成数据解卷积测试
在SYN Data A（6种细胞等比例混合）中，ReDeconv预测比例与真实值偏差<0.5%，而BayesPrism对L5 ET神经元比例高估142.4%，MuSiC对星形胶质细胞比例低估87.1%。在非均匀混合的SYN Data E-F中，ReDeconv保持<5%的相对误差，显著优于其他方法（最大误差达210%）。

真实数据验证
在18个细胞系混合样本中，ReDeconv的预测与流式细胞计数结果的Pearson相关系数达0.99，对稀有细胞（占比<20%）的误差较次优方法降低60%。在PBMC分选样本中，能准确识别5种免疫细胞优势群体（准确率100%），而CIBERSORTx将NK细胞误判为CD8⁺ T细胞。

问题机制解析
通过控制变量实验证实：Type-I问题单独存在时，细胞比例预测误差与转录组大小正相关（R=0.89）；Type-II问题会导致基因长度依赖性偏差；二者共存可能产生抵消效应。Type-III问题主要影响稀有细胞类型识别，ReDeconv通过方差建模使其预测稳定性提升3倍（F-test p<0.05）。

这项研究的意义在于：1）首次系统量化了转录组大小差异对scRNA-seq分析的全局影响，挑战了"均一化优先"的传统范式；2）CLTS标准化可作为Seurat/Scanpy等流程的补充模块，提升下游分析可靠性；3）ReDeconv为利用海量历史批量RNA-seq数据（如TCGA）开展单细胞水平再挖掘提供了可行方案。作者指出，未来可进一步探索CLTS在批次效应校正中的应用，并开发基于解卷积结果的表达谱反推功能。该成果为多组学整合时代下异质数据的可比性分析建立了新标准。