苏丹埃博拉病毒糖蛋白与其人内体受体NPC1复合物的低温电镜结构

【字体: 时间:2025年02月03日 来源:Communications Biology 5.2

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  苏丹埃博拉病毒识别人类NPC1的结构基础不仅为苏丹病毒,而且为整个埃博拉病毒属提供了对受体结合、细胞进入、组织趋向性和宿主范围的关键见解。

  

探秘苏丹埃博拉病毒与宿主受体的结合机制:结构生物学视角下的突破


近期,美国明尼苏达大学医学院药理学系等单位的研究人员在Communications Biology期刊上发表了题为 “Cryo-EM structure of Sudan ebolavirus glycoprotein complexed with its human endosomal receptor NPC1” 的论文。该研究聚焦苏丹埃博拉病毒(Sudan ebolavirus,SUDV),解析了其糖蛋白与人类内体受体 NPC1 的复合物冷冻电镜结构,为理解埃博拉病毒属的受体识别、细胞进入机制等提供了关键见解,在病毒学研究领域意义重大。

一、研究背景


埃博拉病毒属是丝状病毒科的一部分,包含五种不同病毒,其中四种可感染人类。蝙蝠被认为是埃博拉病毒的自然宿主,但至今尚未从蝙蝠或其他动物中分离出完整的病毒。在这五种病毒里,埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)最为常见,导致的人类死亡人数最多;苏丹病毒(SUDV)次之,也对全球健康和国家安全构成严重威胁,其近期在乌干达爆发的疫情,病死率接近 50%。目前,针对 EBOV 已有获批的疫苗和治疗方法,然而 SUDV 却缺乏相应对策,且其与内体受体 NPC1 的结构相互作用仍不明确,这限制了对其感染性、组织嗜性和宿主范围的评估,也阻碍了相关疫苗和治疗手段的研发。

埃博拉病毒的糖蛋白(glycoprotein,GP)在病毒进入宿主细胞过程中起关键作用。GP 以同源三聚体形式组装在病毒表面,由受体结合亚基 GP1 和膜融合亚基 GP2 组成。在病毒成熟过程中,三聚体 GP 在 GP1/GP2 连接处被弗林蛋白酶切割,但 GP1 和 GP2 仍通过二硫键和非共价相互作用连接。GP1 亚基包含受体结合位点(receptor-binding site,RBS),起初被聚糖帽和粘蛋白样结构域(mucin-like domain,MLD)覆盖。病毒进入细胞时,GP1 先与非特异性细胞表面因子结合,通过内吞作用进入细胞。在内体中,内体蛋白酶去除聚糖帽和 MLD,暴露出 RBS,RBS 进而与内体膜上的 NPC1 受体结合,随后 GP2 发生构象变化,促使病毒膜与内体膜融合,将病毒基因组释放到宿主细胞胞质中。NPC1 是埃博拉病毒的内体受体,对病毒进入细胞至关重要。此前研究解析了 EBOV GPcl 与全长人类 NPC1 的冷冻电镜结构,以及 EBOV GPcl 与 NPC1-C 的晶体结构,但 SUDV 与 NPC1 的结构相互作用尚未得到实验表征,不同埃博拉病毒序列变异对其与人类 NPC1 结合亲和力的影响也不清楚。

二、研究材料与方法


(一)细胞系与质粒


研究使用了 HEK293T 细胞和 Expi293F 细胞。前者用于伪病毒生产,在添加了 10% 胎牛血清、2 mM L - 谷氨酰胺、100 单位 /mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基(DMEM)中培养;后者用于蛋白表达,在 Expi293 表达培养基中培养。实验所用的 SUDV GP、EBOV GP 和人类 NPC1 基因均由 GenScript 合成,相关基因分别被克隆到特定载体中,用于后续实验。

(二)蛋白表达与纯化


将编码 EBOV GP-ΔM、SUDV GP-ΔM 和人类 NPC1-C 的质粒,利用聚乙烯亚胺(PEI)瞬时转染到 Expi293F 细胞中。转染三天后收集上清液,通过 Ni-NTA 柱和 Superose200 凝胶过滤柱对 GP-ΔM 蛋白进行纯化。使用嗜热菌蛋白酶 L 将 GP-ΔM 消化为 GPcl,再经 Superose200 凝胶过滤柱进一步纯化。人类 NPC1-C 蛋白则通过 Strep-Tactin XT 柱和 Superose200 凝胶过滤柱进行纯化。

(三)表面等离子共振(SPR)


利用 Biacore S200 系统,通过 SPR 技术测定重组 GPcl(来自 EBOV 或 SUDV)与重组人类 NPC1-C 的结合亲和力。将重组 GPcl 通过化学交联固定在 CM5 传感器芯片上,以不同浓度(1.25 μM 至 20 μM)的人类 NPC1-C 在特定缓冲液中注入,使用 Biacore Evaluation Software 分析数据。

(四)伪病毒细胞进入测定


通过共转染 HEK293T 细胞制备 SUDV 伪病毒,转染质粒包括编码全长 SUDV GP 的 pcDNA3.1 (+) 质粒、编码 HIV 骨架的辅助质粒 psPAX2 和报告质粒 plenti-CMV-luc。收获伪病毒后,用嗜热菌蛋白酶 L 处理使其 GP 裂解为 GPcl,再用于感染瞬时表达全长人类 NPC1 的 293 T 细胞。48 小时后裂解细胞,加入荧光素酶底物,使用 EnSpire 酶标仪测量相对光单位(RLUs),以此评估 SUDV 伪病毒的进入效率。

(五)冷冻电镜数据收集、处理、模型构建与精修


将 SUDV GPcl 和人类 NPC1-C 按 1:4 的摩尔比混合并稀释至 0.3 mg/mL,取 4 μL 混合物滴加到铜网上,经处理后在液氮乙烷中快速冷冻。使用配备特定探测器和能量过滤器的 300 kV FEI Titan-Krios 透射电子显微镜采集图像,用 cryoSPARC v4.5.1 软件处理数据,以 5F1B 为起始模型在 Coot-0.8.9 中进行初始模型构建,在 Phenix-1.16 中进行精修,并结合 Coot-0.8.9 中的手动调整。

三、研究结果


(一)SUDV GPcl 与人类 NPC1 的结合


研究人员表达并纯化了 SUDV GPΔM、EBOV GP-ΔM 和 hNPC1-C,经蛋白酶解得到 SUDV GPcl 和 EBOV GPcl。通过 SPR 测量发现,SUDV GPcl 和 EBOV GPcl 与 hNPC1-C 的解离常数(Kd)分别为 2.41 μM 和 20.4 μM,表明 SUDV GPcl 与 hNPC1-C 的结合力约为 EBOV GPcl 的九倍。

(二)SUDV GPcl 与人类 NPC1 复合物的结构


冷冻电镜解析出 SUDV GPcl 与 hNPC1-C 复合物的结构,分辨率达 3.31 ?。结构显示,三聚体 SUDV GPcl 有两个拷贝的 hNPC1-C 与之结合。对比 SUDV GPcl/hNPC1-C 复合物和 EBOV/hNPC1-C 复合物的结构,发现二者整体结合模式相似,但 SUDV RBS 与 hNPC1-C 的结合界面存在关键差异。在 SUDV RBS/hNPC1-C 界面,Loop 1 发生显著构象变化,相比 EBOV RBS/hNPC1-C 界面,Loop 1 远离 RBS 超过 6 ?,这主要由 SUDV RBS 中 S142Q 的残基变化导致,Gln142 较大的侧链推开了 Loop 1,使 EBOV RBS 中存在的主链堆积相互作用在 SUDV RBS 中消失,因此 Gln142 不利于 hNPC1-C 结合。虽然 hNPC1-C 的 Loop 2 在两个界面构象相似,但由于 RBS 区域残基差异,具体相互作用不同。在 SUDV RBS/hNPC1-C 界面,Pro148 与 hNPC1-C 的 Asp502 形成疏水堆积相互作用,Ala141 因较小的疏水侧链远离 Tyr423 的极性羟基,且与 Ile79 形成有利的疏水相互作用,这些变化都增强了 SUDV GPcl 与 hNPC1-C 的结合。

(三)结构数据的生化验证


为验证结构数据,研究人员进行了两项生化实验。一是通过 SPR 实验检测 hNPC1-C 与多种 SUDV GPcl 变体的结合情况,这些变体包含从 SUDV RBS 到 EBOV RBS 的残基突变(I79V、A141V、Q142S、P148A 及 A141V/Q142S/P148A 三重突变)。结果显示,I79V、A141V 和 P148A 突变降低了 SUDV GPcl 与 hNPC1-C 的结合亲和力,Q142S 突变则增加了结合亲和力,A141V/Q142S/P148A 三重突变也降低了结合亲和力。二是进行 SUDV 伪病毒进入实验,使用含有相同突变的 SUDV GPcl 构建伪病毒感染表达 hNPC1 的人类细胞。结果表明,I79V、A141V 和 A141V/Q142S/P148A 突变减少了 SUDV 伪病毒进入,Q142S 突变增强了进入,P148A 突变有减少进入的趋势,但结果无统计学意义。这些生化实验结果与结构数据相符,表明 SUDV 和 EBOV GPcl 之间的残基差异通常有利于 SUDV GPcl 与 hNPC1 结合,除了残基 142。

四、研究结论与讨论


本研究发现 SUDV GPcl 与人类 NPC1 的结合力比 EBOV GPcl 强约九倍,RBS 区域中只有四个残基(79、141、142 和 148)的差异是 SUDV GPcl 具有更强受体结合亲和力的关键决定因素。通过冷冻电镜结构解析,明确了这四个 RBS 残基变化在与 hNPC1-C 结合中的结构作用。生化实验进一步验证了结构发现,表明这些残基差异影响病毒与受体的结合及病毒进入细胞的过程。较高的 NPC1-C 结合亲和力可能使 SUDV 更容易进入细胞,甚至感染 NPC1 表达较低的组织,但病毒的感染性和组织嗜性还受其他多种因素影响。

对埃博拉病毒属中五种病毒的 RBS 区域序列分析显示,只有本研究中检测的四个残基在不同病毒间存在变异。基于 hNPC1-C 结合亲和力,SUDV 最高,RESTV 最低,这可能解释 RESTV 对人类缺乏致病性,但埃博拉病毒的发病机制复杂,该发现需进一步实验验证。此外,研究还对埃博拉病毒的动物起源和宿主范围进行了探讨。此前研究表明,蝙蝠 NPC1 中的 D502F 突变使其难以被 EBOV GPcl 识别,可能是蝙蝠的一种进化适应。本研究发现,在 SUDV RBS / 蝙蝠 NPC1 界面,Phe502 可与 Pro148 形成疏水相互作用,而 EBOV RBS 中无法形成这种相互作用,这为之前关于埃博拉病毒潜在宿主范围的研究提供了分子解释。

这项研究不仅加深了对 SUDV 受体结合、细胞进入、组织嗜性和宿主范围的理解,还推动了对整个埃博拉病毒属受体结合的认识。其为开发针对 SUDV 及其他埃博拉病毒的治疗方法和疫苗提供了重要结构基础,有助于评估病毒的传播风险和潜在宿主范围,对公共卫生防控具有重要指导意义。未来研究可在此基础上,进一步探索其他影响埃博拉病毒感染性和致病性的因素,以及开发更有效的干预措施。

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