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Ewing肉瘤(ES)是由致癌融合蛋白EWSR1::FLI1驱动的。在这里,作者发现半乳糖转移酶C1GALT1稳定Smoothened蛋白,激活Hedgehog信号并促进ES细胞中EWSR1::FLI1的转录,这可能是抗真菌药物伊曲康唑抑制C1GALT1的治疗靶点。
揭示尤文肉瘤治疗新靶点:C1GALT1 的关键作用
美国马萨诸塞大学陈医学院(University of Massachusetts Chan Medical School)的研究人员在Nature Communications杂志上发表了题为 “The O-glycosyltransferase C1GALT1 promotes EWSR1::FLI1 expression and is a therapeutic target for Ewing sarcoma” 的论文。该研究意义重大,为尤文肉瘤(Ewing sarcoma,ES)的治疗提供了全新的潜在靶点和治疗策略,有望改善 ES 患者的预后。
一、研究背景
尤文肉瘤是一种侵袭性骨癌,主要发生于儿童和年轻人,目前的治疗方法包括强化化疗、放疗和 / 或手术,但对于转移性或复发性疾病的治疗进展有限,5 年生存率仅为 20 - 30%,且尚无获批的靶向疗法。尤文肉瘤的特征是染色体易位,产生致癌融合蛋白 EWSR1::FLI1,它对肿瘤细胞的生存和生长至关重要,是极具潜力的治疗靶点。然而,EWSR1::FLI1 作为转录因子缺乏酶活性,传统小分子抑制剂难以对其进行靶向治疗,因此寻找促进 EWSR1::FLI1 表达的可成药靶点成为研究的关键方向。
二、研究材料与方法
- 细胞系与培养:使用多种细胞系,包括 A673、SK-N-MC、IMR-90、NIH 3T3、HepG2、TC-32、TC-71 和 TC-106 等,在不同的培养基中培养,并添加相应的血清、抗生素等,确保细胞正常生长。通过转染、感染等方式构建稳定表达特定基因或蛋白的细胞系,如构建 A673/EWSR1::FLI1-tdTomato/EGFP/Cas9 报告细胞系用于后续实验。
- CRISPR/Cas9 筛选:利用 CRISPR/Cas9 技术构建报告细胞系,用 Brunello 人 CRISPR 敲除混合慢病毒文库转导细胞,经嘌呤霉素筛选、荧光激活细胞分选(FACS)和深度测序,识别促进 EWSR1::FLI1 表达的基因。
- 基因编辑与干扰:运用 CRISPR 基因编辑技术敲除特定基因,如 C1GALT1;通过 shRNA 和 siRNA 技术分别实现稳定和瞬时的基因敲低,研究基因功能。
- 检测方法:采用定量 RT-PCR 检测基因表达水平;免疫印迹分析检测蛋白表达;染色质免疫沉淀测定(ChIP)分析蛋白与 DNA 的结合;GLI 报告基因检测 Hh 信号通路活性;O - 糖基化测定分析蛋白的 O - 糖基化修饰等。
- 动物实验:将细胞接种到 NOD-scid IL2Rgammanull(NSG)小鼠体内,构建肿瘤模型,观察肿瘤生长情况;对小鼠进行药物处理,评估药物疗效;通过免疫组化分析肿瘤组织中相关蛋白的表达。
三、研究技术路线
- 构建报告细胞系:利用 CRISPR/Cas9 介导的同源定向修复,将 tdTomato cDNA 等元件构建到 A673 细胞的 EWSR1::FLI1 基因位点,再导入 Cas9 和 EGFP 表达质粒,构建出 A673/EWSR1::FLI1-tdTomato/EGFP/Cas9 报告细胞系。
- CRISPR/Cas9 筛选促进 EWSR1::FLI1 表达的基因:用 Brunello 文库转导报告细胞系,筛选出 tdTomatolow EGFPhigh 的细胞群体,经深度测序和数据分析,确定候选基因,再通过敲低实验验证。
- 研究 C1GALT1 对 EWSR1::FLI1 的影响:对 C1GALT1 进行基因敲除、敲低实验,使用药物抑制其活性,检测 EWSR1::FLI1 及相关蛋白和基因的表达变化。
- 探究 C1GALT1 影响 EWSR1::FLI1 的机制:研究 C1GALT1 与 Hh 信号通路的关系,以及对 SMO 的 O - 糖基化修饰和稳定性的影响。
- 验证 C1GALT1 在细胞转化和肿瘤生长中的作用:通过软琼脂集落形成实验、动物肿瘤形成实验,验证 C1GALT1 对细胞转化和肿瘤生长的影响。
- 评估 ITZ 对 ES 细胞和肿瘤的作用:用 ITZ 处理 ES 细胞系和小鼠肿瘤模型,检测细胞活力、肿瘤生长及相关蛋白表达,探究 ITZ 的作用机制和疗效。
四、研究结果
(一)全基因组 CRISPR/Cas9 筛选确定促进 EWSR1::FLI1 表达的因子
研究人员构建了表达 Cas9 和 EGFP 的 A673/EWSR1::FLI1-tdTomato 报告细胞系,用包含约 76,000 个 sgRNAs 的 Brunello 文库进行转导筛选。经嘌呤霉素筛选、FACS 分选和深度测序,确定了约 70 个候选基因,从中选取排名前 20 的基因进行验证。最终鉴定出 9 个促进 EWSR1::FLI1 表达的因子,包括 C1GALT1,且敲低这些因子可降低 EWSR1::FLI1 的 mRNA 水平。
(二)O - 半乳糖基转移酶 C1GALT1 在 ES 细胞中高表达,其遗传或药理抑制降低 EWSR1::FLI1 水平和功能
CRISPR/Cas9 敲除 A673 细胞中的 C1GALT1 可消除 EWSR1::FLI1 表达,shRNA 敲低 C1GALT1 或其伴侣蛋白 C1GALT1C1 也有类似效果。此外,敲低 C1GALT1 影响 EWSR1::FLI1 靶基因的表达。免疫组化显示,C1GALT1 在 ES 肿瘤中高表达,在正常组织中不表达,且高表达与患者总生存期降低相关。FDA 批准的抗真菌药物伊曲康唑(ITZ)可抑制 C1GALT1,处理 A673 细胞后,EWSR1::FLI1 的 mRNA 和蛋白水平呈剂量依赖性降低,同时影响其靶基因表达,且排除了 ITZ 通过抑制 CYP51A1/CYP3A4 影响 EWSR1::FLI1 表达的可能性。
(三)EWSR1::FLI1 表达受 Hh 信号通路促进
ITZ 可抑制 Hh 信号通路,该通路在胚胎发育和癌症发展中起重要作用。研究发现,敲低 A673 细胞中 Hh 信号通路的关键成分 SMO、GLI1 或 GLI2,或用相应抑制剂处理,可降低 EWSR1::FLI1 的 mRNA 和蛋白水平;相反,用 Hh 激活剂 SAG 处理则可增加其表达。ChIP 实验表明,GLI1 和 GLI2 可结合到 EWSR1 启动子区域,敲除部分结合位点会降低 EWSR1::FLI1 表达,说明 Hh 信号通路直接促进 EWSR1::FLI1 表达,且二者存在反馈调节。
(四)C1GALT1 刺激 ES 细胞中的 Hh 信号通路
敲低 A673 细胞中的 C1GALT1 或用 ITZ 处理,会降低 SMO 和 GLI1 的 mRNA 和蛋白水平,抑制 Hh 信号通路活性,减少 GLI1 和 GLI2 与 EWSR1 基因的结合。在 NIH 3T3 细胞中异位表达 C1GALT1,可增加 SMO 和 GLI1 水平,促进 Hh 信号通路活性,表明高表达的 C1GALT1 可刺激 Hh 信号通路。
(五)C1GALT1 促进 ES 细胞中 SMO 的 O - 糖基化和稳定
通过凝集素下拉实验和免疫共沉淀实验,证实 SMO 是 C1GALT1 的靶蛋白,在 ES 细胞中发生 O - 糖基化且与 C1GALT1 相互作用。抑制 C1GALT1 活性会降低 SMO 的 O - 糖基化水平和稳定性,使 SMO 半衰期缩短,且 SMO 的 O - 糖基化缺陷突变体表达水平低,易通过蛋白酶体和 / 或溶酶体途径降解,说明 C1GALT1 介导的 SMO O - 糖基化增强了其稳定性。
(六)C1GALT1 是 EWSR1::FLI1 介导的细胞转化所必需的
在 A673 细胞中,敲低 C1GALT1 或 SMO 显著降低细胞在软琼脂中的集落形成能力和在小鼠体内的成瘤能力,且肿瘤组织中相关蛋白表达减少,细胞增殖能力降低。在 NIH 3T3 细胞中,敲低 C1GALT1 或 SMO 可抑制 EWSR1::FLI1 介导的细胞转化,而异位表达 C1GALT1 可通过刺激 Hh 信号通路使 NIH 3T3 细胞发生转化,且该转化作用依赖于 SMO。
(七)ITZ 抑制人 ES 细胞系的增殖并抑制 ES 异种移植瘤在小鼠体内的生长
在表达高水平 C1GALT1 的 ES 细胞系中,敲低 C1GALT1 或用 ITZ 处理可抑制 Hh 信号通路和 EWSR1::FLI1/ERG 表达,降低细胞活力,诱导细胞凋亡。ITZ 对 ES 细胞的抑制效果优于传统 SMO 抑制剂,且其作用主要通过抑制 C1GALT1 介导的 Hh 信号通路实现。在小鼠 ES 异种移植瘤模型中,ITZ 处理显著抑制肿瘤生长,降低肿瘤组织中相关蛋白表达,且该抑制作用可被异位表达的 EWSR1::FLI1 抵消,表明 ITZ 通过抑制 C1GALT1 影响 ES 肿瘤生长。
五、研究结论
本研究通过全基因组 CRISPR/Cas9 筛选,发现 C1GALT1 可促进 ES 细胞中 EWSR1::FLI1 的表达。C1GALT1 通过 O - 糖基化修饰 SMO,稳定 SMO 蛋白,激活 Hh 信号通路,进而促进 EWSR1::FLI1 表达,形成正反馈调节。抑制 C1GALT1,无论是通过基因编辑还是使用 ITZ 等药物,均可降低 SMO 的 O - 糖基化水平,抑制 Hh 信号通路和 EWSR1::FLI1 表达,减少 ES 细胞活力,抑制肿瘤生长。该研究揭示了一种促进 EWSR1::FLI1 表达和 ES 肿瘤生长的可治疗靶点机制,为 ES 的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。
六、研究讨论
(一)C1GALT1 在 ES 中的作用机制
此前研究表明 C1GALT1 在多种癌症中发挥作用,本研究明确在 ES 中其主要靶点可能是 SMO,但不排除它通过糖基化其他底物促进肿瘤生长的可能性。ES 细胞对 SMO 的持续需求可能与 SMO 使 SUFU 失活、促进 GLI 转录因子入核有关。
(二)ITZ 的作用及优势
ITZ 作为一种已获批的抗真菌药物,可通过抑制 C1GALT1 间接作用于 SMO,影响 Hh 信号通路和 EWSR1::FLI1 表达。与传统 SMO 抑制剂相比,ITZ 在 ES 细胞中表现出更高的疗效,且 ES 细胞对传统 SMO 抑制剂的相对不敏感可能与 C1GALT1 诱导的 SMO 糖基化有关,这为 ES 治疗提供了新的方向。
(三)临床应用前景
ITZ 在动物实验中的有效剂量在临床抗真菌治疗中可达到,且前期临床研究表明其对基底细胞癌有一定疗效。因此,针对 ITZ 单药或与其他 Hh 通路拮抗剂联合治疗 ES 的临床试验值得开展,有望为 ES 患者带来更有效的治疗方案,改善患者的预后。
综上所述,该研究发现 C1GALT1 在尤文肉瘤发生发展中的关键作用,为开发新的治疗策略提供了重要理论依据和潜在靶点,ITZ 作为治疗尤文肉瘤的药物具有一定的临床应用前景,值得进一步深入研究。