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针对保守的流感HA锚定表位的结构趋同抗体为下一代疫苗的开发提供了模板。作者鉴定了四种锚定抗体,这些抗体由多种种系基因编码,对H1N1流感病毒具有广泛的中和活性。
流感病毒研究新突破:靶向 HA 锚定表位的结构趋同抗体
在流感病毒研究领域,来自斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute)整合结构与计算生物学系的 Ting-Hui Lin 等研究人员取得了重要进展。他们的研究成果以 “Structurally convergent antibodies derived from different vaccine strategies target the influenza virus HA anchor epitope with a subset of VH3 and VK3 genes” 为题,发表于《Nature Communications》期刊。这一研究对于深入理解流感病毒抗体的作用机制、推动通用流感疫苗的研发具有重要意义。
一、研究背景
流感病毒长期在人群中传播,除了引发大流行,当前季节性甲型流感病毒每年还会导致超过 10% 的人口感染,造成多达 65 万人死亡。由于抗原漂移,现有的季节性流感疫苗需每年更新,而且禽流感病毒如 H5N1、H7N9 等的零星爆发,以及流感病毒在不同物种间的传播风险,使得研发一种能诱导产生针对多种流感病毒的保护性抗体的通用流感疫苗迫在眉睫。
血凝素(HA)作为流感病毒的主要表面蛋白,是中和抗体的主要靶点。基于抗原多样性,甲型流感病毒的 HA 可分为 18 或 19 个亚型,分为第 1 组和第 2 组。HA 由球状头部和茎部结构域组成,头部结构域的受体结合位点高度多样,而茎部结构域相对保守。因此,针对头部结构域的抗体通常具有菌株特异性,易受抗原漂移影响;而针对茎部结构域的抗体则具有更高的交叉反应性。过去十年,流感疫苗研发旨在诱导产生广泛中和抗体(bnAbs),已有多种人类 bnAbs 被鉴定和表征,它们大多识别 HA 的保守茎部结构域。为了诱导产生 bnAbs,研究人员采用了多种疫苗策略,如异源菌株加强疫苗策略、使用嵌合 HA(cHAs)和无头 HA 等。
二、研究材料与方法
(一)研究材料
研究中使用的抗体是从先前研究中接种单价或四价季节性灭活病毒(MIV、QIV)或嵌合第 1 组 HA(cHA)疫苗的个体中筛选得到的。用于生物膜干涉(BLI)分析和结构测定的 HA 在昆虫细胞表达系统或 expi293F 表达系统中产生,抗体 Fab 片段则通过将相应的基因序列克隆到表达载体中,在 ExpoCHO 细胞中表达并纯化。
(二)研究方法
晶体学与冷冻电镜技术 :通过将 Fab 与 HA 按一定比例混合,孵育后进行纯化,然后利用坐滴气相扩散法进行结晶筛选,获得 HA - Fab 复合物的晶体。对于冷冻电镜样品,同样先制备复合物,添加去污剂后在特定条件下制备冷冻电镜网格。利用同步辐射光束线收集晶体衍射数据和冷冻电镜数据,通过分子置换法求解相位,在相关软件中进行模型构建和精修。
结合能力与亲和力测定 :采用 BLI 技术,将 Fab 或 HA 固定在生物传感器上,在特定缓冲液中测定它们之间的结合能力和亲和力。
微中和试验 :使用表达人 2,6 - 唾液酸转移酶的 Madin - Darby 犬肾细胞(SIAT1 - MDCK),将抗体与病毒混合后加入细胞培养板,孵育后通过检测细胞活力来计算半数有效浓度( ),评估抗体的中和能力。
热稳定性试验 :在 ExpiCHO 细胞中表达野生型和突变型 Fab,通过监测不同温度下的热稳定性变化,分析突变对抗体结构稳定性的影响。
免疫球蛋白序列分析 :利用 IgBLAST 和国际免疫遗传学信息系统(IMGT)分析抗体的种系基因使用、互补决定区(CDRs)、VDJ 基因重排以及与种系的序列同一性等。
三、研究结果
(一)锚定抗体的鉴定
研究人员从不同个体中筛选出 4 种抗体(047 - 09_4F04、241_2F04、346 - 54 和 SFV009_3G01),它们均与 HA 的膜近端锚定区域结合。这些抗体由不同的$V_{H}
基 因 ( V_{H}
、 V_{H}
、 V_{H}
和 V_{H}
) 和 V_{K}
基 因 ( V_{K}
和 V_{K}$3 - 15)编码,尽管其基因使用存在一定差异,但均能广泛结合 1934 年至 2019 年间分离的 H1N1 HAs,并在体外微中和试验中对多种 H1N1 病毒表现出中和能力。通过与已知的 222 - 1C06 抗体比较,进一步证实了这些抗体的结合特性。研究人员通过分析抗体的基因序列和结合特性,得出了这些结论。
(二)抗体与 HA 复合物的结构特征
047 - 09_4F04 Fab 与 CA04 H1 HA 复合物的结构 :047 - 09_4F04 抗体的重链由$V_{H}、 D_{H}和 J_{H}编 码 , 轻 链 由 V_{K}和 J_{K}$4 编码。该抗体通过所有六个 CDR 以及 LFR2 与 CA04 HA 的锚定区域接触,重链的 HCDR2 和 HCDR3 在与 HA 的相互作用中起主要作用,体细胞超突变(SHM)残基 L55 和 S56 以及种系编码残基在结合中发挥重要作用。轻链的 LCDR3 也对结合有重要贡献,通过分析晶体结构和进行丙氨酸扫描实验,研究人员明确了各残基的作用。
241_2F04 Fab 与 CA04 H1 HA 复合物的结构 :241_2F04 抗体的重链由$V_{H}、 D_{H}和 J_{H}编 码 , 轻 链 由 V_{K}和 J_{K}$5 编码。它通过重链的 HCDR2 和 HCDR3 以及轻链的 LCDR1 和 LCDR3 与 HA 结合,重链的 HCDR2 和 HCDR3 贡献较大的结合表面积,且存在类似的丝氨酸氢键网络。轻链主要通过 LCDR3 与 HA 相互作用,研究人员通过解析晶体结构和结合位点分析,得出这些结构特征。
346 - 54 Fab 与 CA04 H1 HA 复合物的结构 :346 - 54 抗体的重链由$V_{H}、 D_{H}和 J_{H}编 码 , 轻 链 由 V_{K}$3 - 11 编码。该抗体通过重链的 HCDR2 和 HCDR3 以及轻链的 LCDR1、LCDR3 和 LFR3 与 HA 结合,HCDR3 主要通过疏水相互作用与 HA 的上、中口袋结合,轻链的 LCDR3 也有重要贡献。通过晶体结构分析和结合实验,确定了其结合模式和关键残基。
SFV009_3G01 Fab 与 CA04 H1 HA 复合物的结构 :SFV009_3G01 抗体由$V_{H}和 V_{K}$3 - 11 编码。它通过 HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2 和 LCDR3 与 CA04 H1 HA 相互作用,HCDR2 中的 T55 与 HA 的下口袋形成疏水相互作用,HCDR3 主要与上、中口袋结合,轻链的 LCDR3 与其他抗体类似,对结合起重要作用。通过冷冻电镜结构解析和结合特性研究,揭示了其结构特征。
(三)LCDR3 中关键 NWPP 基序的作用
所有锚定抗体通过类似的受限模式与锚定区域结合,主要由 LCDR3 决定。研究发现,所有锚定抗体的 LCDR3 具有一个保守的 10 - 残基序列,包含
基序。通过丙氨酸扫描和结构分析表明,该基序对抗体与 HA 的结合至关重要,突变该基序中的残基会显著降低或消除结合亲和力,影响抗体的结合构象和稳定性。研究人员通过对多个抗体的 LCDR3 序列和结构比较,以及突变实验,确定了该基序的重要性。
(四)锚定抗体 CDR 环中疏水残基的作用
虽然轻链 CDR3 的 NWPP 基序在决定结合模式中起主导作用,但重链 CDR3 在结合表面积上占主导。不同抗体的 HCDR3 序列多样,但主要通过疏水相互作用与 HA 的上、中锚定区域结合。对疏水残基进行丙氨酸扫描发现,突变这些残基会显著降低抗体与 HA 的结合亲和力,表明疏水残基在锚定抗体与 HA 结合中具有重要作用。此外,轻链和重链 CDR 环之间的疏水和芳香相互作用也稳定了 CDR 结构,影响了对 HA 的识别模式。研究人员通过结构比较、结合亲和力测定和突变实验,深入分析了疏水残基的作用。
(五)$V_{K}和 V_{K}与 部 分 V_{H}$3 重链的功能互补
通过交换抗体的轻链进行功能互补实验,结果表明,含有$V_{H}
、 V_{H}
、 V_{H}
和 V_{H}
重 链 的 锚 定 抗 体 似 乎 与 V_{K}
或 V_{K}$3 - 15 轻链兼容,尽管不同配对的结合动力学有所不同,但大多数配对仍能保留对 CA04 H1 HA 的结合能力。研究人员通过构建不同轻链和重链组合的抗体,并检测其结合活性,得出了功能互补的结论。
(六)锚定抗体的表位分析
锚定抗体的表位与大多数 bnAbs 识别的中央茎表位不同,与第 2 组特异性抗体 CR8020 的表位有部分重叠。通过对 HA2 中关键结合残基进行丙氨酸扫描发现,突变 W14、H25、I133、Y141、Q27、S32 和 Y34 等残基会显著影响抗体与 HA 的结合,表明这些残基在锚定抗体与 HA 的相互作用中至关重要。此外,尽管 H1N1 和 H3N2 的锚定表位残基有一定相似性,但现有锚定抗体无法对第 2 组 HA 产生交叉反应,存在遗传屏障。研究人员通过表位比对、突变实验和结合亲和力测定,分析了锚定抗体的表位特征和遗传屏障。
四、研究结论与讨论
本研究深入分析了不同疫苗策略诱导产生的针对流感病毒 HA 膜近端锚定区域的抗体,揭示了其结构基础和结合模式。与多供体茎结合 bnAbs 不同,这些锚定抗体通过种系编码的 HCDR2 中的 Y98、LCDR3 中的保守 NWPP 基序、HCDR2、HCDR3 和 LCDR3 之间的芳香相互作用以及 HCDR3 尖端的疏水残基靶向锚定表位。这种结构趋同的特征可能是抗体靶向该保守表位的关键因素,即使抗体的 VDJ 基因重排不同。
研究还发现,锚定抗体对多种 H1N1 病毒具有中和能力,为季节性和未来 H1N1 大流行提供了解决方案。尽管锚定表位在 H1N1 和 H3N2 中相对保守,但现有锚定抗体难以对第 2 组病毒产生交叉反应,未来是否能鉴定出具有交叉反应的锚定 bnAbs 仍是一个开放问题。不过,具有低水平 SHM 的锚定抗体的趋同解决方案有望通过下一代疫苗策略在不同个体中有效诱导产生。
这一研究成果为通用流感疫苗的设计提供了重要的理论基础,有助于推动流感疫苗研发从传统的快速应对向诱导产生广泛中和抗体的方向发展,对于提高流感防控能力具有重要的科学意义和潜在的应用价值。同时,也为其他病毒疫苗的研发提供了借鉴,启发研究人员从抗体结构和结合机制入手,寻找更有效的疫苗设计策略。