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癌蛋白ANLN调节有丝分裂过程中的收缩环组装,已被报道为癌蛋白。在这里,作者报道了核ANLN通过与RNA Pol II相互作用并促进其聚类和相分离在基因转录调控中的作用。
核内 ANLN 调控转录起始相关的 Pol II 聚集及靶基因表达研究解读
汕头大学医学院分子生物学重点实验室(高发癌症潮汕沿海地区)的研究人员在Nature Communications期刊上发表了题为 “Nuclear ANLN regulates transcription initiation related Pol II clustering and target gene expression” 的论文。该研究揭示了核内 ANLN 在转录调控中的功能,为食管癌治疗提供了理论依据,对癌症研究领域意义重大。
一、研究背景
(一)ANLN 的研究现状
Anillin(ANLN)作为一种有丝分裂蛋白,能与 F - 肌动蛋白、肌球蛋白 II 和 RhoA 等细胞骨架元件相互作用,调节细胞分裂,在有丝分裂中组织收缩环组件,推动有丝分裂进程。此前研究发现,ANLN 蛋白丰度对食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞分裂和恶性进展至关重要。然而,在细胞长达 20 小时的间期,ANLN 会分布于细胞核中,其在核内的功能尚不明确,仅靠调节收缩环组装难以完全解释其促癌机制。此外,虽有研究表明 ANLN 在不同细胞中有非有丝分裂功能,如调节细胞间连接、信号转导和细胞运动,但 ANLN 是否直接参与这些过程,尤其是核内 ANLN 的作用,仍有待解答。
(二)RNA 聚合酶 II(Pol II)的研究现状
RNA 聚合酶 II 由 12 个亚基组成,负责转录真核生物基因组中所有蛋白质编码基因。多种蛋白质和蛋白质复合物通过与 Pol II 相互作用来调节其活性,这些复合物会在细胞核特定区域通过液 - 液相分离(LLPS)聚集,形成转录凝聚物或 Pol II 簇。其中,Pol II 最大亚基 POLR2A 的羧基末端结构域(CTD)是驱动 Pol II 聚集的中心枢纽,它由 52 个七肽重复序列组成,属于内在无序区域(IDR)。虽然 CTD 在体外足以形成相分离液滴,但细胞核中 Pol II 簇的形成受多种机制调控,不同类型的 Pol II 簇参与转录激活、RNA 加工和三维基因组组织等过程。研究 Pol II 簇的调控机制,对深入了解癌症转录扩增机制至关重要。
二、研究材料与方法
(一)细胞培养与处理
使用多种细胞系,包括 KYSE150、KYSE510、HEK293T 等,根据细胞类型选择合适的培养基进行培养。通过小干扰 RNA(siRNA)、多西环素(Dox)诱导等方法敲低 ANLN 表达;用 1,6 - 己二醇(1,6 - HD)处理细胞以溶解 LLPS 凝聚物;使用小分子 THZ1 处理细胞,探究其对 ANLN - Pol II 轴的影响。
(二)实验技术
- 蛋白质相互作用检测:运用内源性共免疫沉淀、体外 pulldown 实验、邻近连接分析(PLA)等技术,确定 ANLN 与 Pol II 的相互作用及作用区域。
- 基因表达分析:采用 RNA - Seq 分析 ANLN 敲低对全局基因表达的影响;利用 CUT&Tag 分析 Pol II 和 H3K27ac 的染色质结合情况;通过 ChIP - qPCR 验证 ANLN 和 Pol II 在靶基因启动子区域的结合;运用 RT - qPCR 检测靶基因的表达水平。
- 细胞成像技术:借助免疫荧光染色、超分辨率成像技术,观察 ANLN 和 Pol II 在细胞内的定位、聚集情况。
- 蛋白质表达与纯化:构建相关质粒,在原核细胞中表达并纯化蛋白质,用于体外实验,如液滴实验、FRAP 分析等。
(三)技术路线
首先通过多种实验方法确定核内 ANLN 与 Pol II 的相互作用,接着研究 ANLN 对 Pol II 聚集和相分离的影响,然后分析 ANLN 对基因转录活性和 Pol II 染色质结合的调控作用,再鉴定 ANLN 的直接靶基因,最后探究小分子 THZ1 对 ANLN - Pol II 轴及 ESCC 细胞增殖的影响。
三、研究结果
(一)核 ANLN 直接与 Pol II 大亚基相互作用
在多种癌细胞中证实 ANLN 在间期存在于细胞核,在有丝分裂时位于收缩环。细胞分级分离显示核内 ANLN 与染色质相关,且 ANLN 与新生转录本共定位。从 ANLN 相互作用组中鉴定出多种与基因转录相关的蛋白,包括 Pol II 亚基。共免疫沉淀实验表明 ANLN 存在于 Pol II 复合物中,进一步的缺失突变分析确定了 ANLN 与 Pol II 相互作用的关键氨基酸区域。体外 pulldown 实验和 PLA 实验证实 ANLN 直接与 Pol II 大亚基的 C 末端 846 - 1592 aa 及 CTD 结构域相互作用。
(二)ANLN 和 Pol II 形成凝聚物并共定位于基因 TSS 区域
通过 CUT&Tag 实验发现 Pol II 和 ANLN 在基因组中共定位,且都占据许多活跃基因的转录起始位点(TSS)。超分辨率成像显示,在 HeLa 和 KYSE150 细胞中,Pol II - pS5 形成不同大小的蛋白簇,ANLN 形成小尺寸簇,且两者簇的形成对 1,6 - HD 敏感。对细胞进行预提取处理后发现,这些簇部分与染色质结合。进一步分析发现,ANLN 簇通常聚集在 Pol II III 型簇的周边。
(三)ANLN 增强起始相关的 Pol II 聚类
在 HeLa 细胞中沉默 ANLN 表达,超分辨率成像显示 Pol II - pS5 III 型簇数量减少,而小尺寸簇数量和 Pol II - pS5 表达水平不受影响。采用短期敲低 ANLN 的方法,排除有丝分裂缺陷的影响,在 KYSE150 细胞中也得到类似结果,且重新引入 HA 标记的 ANLN 可挽救 Pol II 簇的减少。研究还发现 ANLN 对延伸阶段 Pol II 簇的影响较小。通过构建 ANLN 核定位缺陷突变体,证实 ANLN 对 Pol II - pS5 簇的促进作用依赖于其核定位。此外,ANLN 促进 Pol II 聚类的功能独立于其与肌动蛋白的结合,且通过其 IDR 中的关键残基促进 Pol II 聚类,这一过程与相分离相关。
(四)ANLN 在体外促进 Pol II CTD 相分离
体外液滴实验表明,CTD 和 ANLN 重组蛋白在葡聚糖工作缓冲液中可形成浓度依赖性的凝聚物,且破坏疏水相互作用会减少液滴形成。FRAP 分析显示,CTD 和 ANLN 液滴在光漂白后可快速融合和恢复。ANLN 能浓度依赖性地增加 CTD 液滴的大小和凝聚分数,在近生理浓度下,ANLN 分布在 CTD 液滴周边。低 RNA 水平促进 ANLN - CTD 凝聚物形成,高 RNA 水平则抑制,DNA 对其凝聚物形成的调节作用小于 RNA。缺失关键相分离驱动氨基酸的 ANLN PS mut 重组蛋白促进 CTD 相分离的能力显著减弱,且导致 CTD 分布紊乱。
(五)ANLN 调节基因转录活性和 Pol II 染色质结合
RNA - Seq 分析显示,ANLN 敲低后,数千个基因的表达发生变化,下调基因主要参与癌症相关信号通路,上调基因多与细胞应激、DNA 损伤反应和细胞凋亡相关。CUT&Tag 分析发现,ANLN 短期敲低后,H3K27ac 信号在 TSS 附近下降,而 Pol II 在染色质上的沉积增加,但这些 Pol II 在高盐洗涤条件下易从染色质上解离,表明其活性可能降低。荧光素酶报告基因实验也证实 ANLN 快速敲低会导致 Pol II 活性下降。此外,ANLN 敲低对超级增强子上的 H3K27ac 信号抑制作用较强,说明 ANLN 通过调节典型增强子和超级增强子的活性,调控特定基因子集的表达。
(六)ANLN 直接靶基因的鉴定
结合 RNA - Seq 和 CUT&Tag 技术,筛选出 84 个受 ANLN - Pol II 轴直接调控的靶基因,ChIP - qPCR 验证了 ANLN 和 Pol II 在这些靶基因启动子区域的结合。功能注释显示,这些靶基因与癌症进展相关的生物学过程和信号转导有关,尤其是氧化还原酶活性、细胞分化和 Wnt 信号通路。RT - qPCR 分析表明,靶基因的表达水平随 ANLN 的敲低而下降。进一步研究发现,这些靶基因均受超级增强子调控,ANLN - Pol II 复合物可能通过与超级增强子结合来调控靶基因表达。此外,从 ANLN 相互作用组和转录因子数据库中筛选出至少 200 个与 ANLN 相互作用的转录因子,它们与 ANLN 和 Pol II 在靶基因启动子或超级增强子区域共定位,表明 ANLN 可与不同转录因子共同调节特定靶基因。
(七)THZ1 抑制 ANLN - Pol II 簇和 ESCC 细胞增殖
小分子 THZ1 作为超级增强子抑制剂,能抑制 ESCC 细胞中由超级增强子调节的转录本。超分辨率成像显示,THZ1 处理可几乎完全溶解 ANLN - Pol II 的 III 型簇,对小尺寸簇影响较小。分析 THZ1 处理的 ESCC 细胞转录组数据发现,ANLN - Pol II 轴的 84 个靶基因对 THZ1 特别敏感,RT - qPCR 验证了 THZ1 处理后这些靶基因表达随时间下降。MTS 细胞增殖实验表明,THZ1 能浓度依赖性地抑制 7 种 ESCC 细胞系的活力,且对正常细胞系的细胞毒性较低。联合使用抑制细胞质 ANLN 的 F806 和 THZ1,对 ESCC 细胞增殖的抑制效果比单独使用两者之和更强。
四、研究结论与讨论
(一)研究结论
本研究证实核内 ANLN 是一种转录调节因子,通过与 Pol II 大亚基直接相互作用,促进起始相关的 Pol II 聚类和靶基因表达。ANLN 通过介导典型增强子和超级增强子的活性,调控特定基因子集的表达,且 ANLN - Pol II 可能与不同转录因子在超级增强子区域结合,形成活性转录簇。超级增强子抑制剂 THZ1 能特异性抑制 ANLN - Pol II 簇、靶基因表达和 ESCC 细胞增殖。
(二)讨论
- ANLN 在转录过程中的作用阶段:ANLN 主要在转录起始阶段发挥作用,但越来越多证据表明转录调节因子常参与多个转录步骤,未来研究应关注 ANLN 在不同转录步骤中的功能。
- ANLN 与 Pol II 相互作用的机制:ANLN 的 N 端 1 - 700 aa 和 Pol II CTD 均含有 IDR,它们之间的复杂多位点相互作用可能有助于在结合界面快速形成和断裂相互作用,促进大凝聚物的形成,这种相互作用模式符合 Flory - Huggins 理论中的贴纸 - 间隔模型。
- ANLN 与肌动蛋白结合蛋白的关系:虽然核肌动蛋白对 Pol II 簇的调节依赖于肌动蛋白聚合,但 ANLN 促进 Pol II 聚类的作用独立于其与肌动蛋白的结合,这为研究肌动蛋白结合蛋白在 Pol II 聚类中的调节作用提供了新视角。
- ANLN 对靶基因调控的细胞特异性:在正常细胞中过表达 ANLN,只有少数靶基因表达发生变化,说明 ANLN 对大多数已鉴定靶基因的调控可能具有癌细胞特异性,其调控基因表达的机制在不同细胞背景下可能不同,探索核内 ANLN 在不同正常细胞中的转录调控功能还需大量研究。
本研究首次明确了核内 ANLN 与 Pol II 转录工厂之间的直接关系,揭示了 ANLN 在转录调控中的真实作用,为以 ANLN 为靶点的癌症研究提供了关键见解,有望推动癌症治疗策略的进一步发展。