核定位Anillin通过调控RNA聚合酶II相分离驱动食管鳞癌转录起始的新机制

本研究揭示了有丝分裂蛋白Anillin(ANLN)在细胞核内的全新功能。研究人员发现核ANLN通过直接结合RNA聚合酶II(Pol II)大亚基形成转录凝聚体，调控氧化还原酶活性、Wnt信号通路等关键基因表达。超级增强子抑制剂THZ1可特异性破坏ANLN-Pol II凝聚体，为食管鳞状细胞癌(ESCC)治疗提供新靶点。

　　

在细胞生物学领域，Anillin(ANLN)长期以来被认为主要参与有丝分裂过程中收缩环的组装调控。然而，这个在多种癌症中过表达的致癌蛋白在长达20小时的细胞间期主要定位于细胞核内，其核功能一直是个未解之谜。更令人困惑的是，仅用ANLN调控收缩环组装的机制难以完全解释其在癌症发生发展中的多重作用。随着对转录调控机制研究的深入，RNA聚合酶II(Pol II)通过液-液相分离(LLPS)形成转录凝聚体的现象备受关注，但调控这一过程的关键因子仍有待发现。

汕头大学医学院等单位的研究人员通过多学科交叉方法，首次揭示核ANLN作为转录调控因子的全新功能。研究发现ANLN直接与Pol II大亚基相互作用，促进转录起始相关Pol II簇的形成和CTD结构域的相分离。该研究不仅阐明了ANLN在转录调控中的分子机制，还发现其靶基因参与氧化还原酶活性和Wnt信号通路等癌症相关过程，为食管鳞状细胞癌治疗提供了新策略。相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究团队运用了多项关键技术：超分辨率结构光照明显微镜(SIM)观察核内蛋白凝聚体；CUT&Tag技术分析染色质结合状态；体外相分离实验验证蛋白互作；Dox诱导快速敲低系统避免有丝分裂干扰；结合RNA-Seq和生物信息学筛选靶基因；以及THZ1药物敏感性测试等。所有实验均在KYSE150等食管鳞癌细胞系中完成。

"核ANLN直接与Pol II大亚基相互作用"部分证实，免疫共沉淀和质谱分析发现ANLN与Pol II复合物存在相互作用，其N端1-300和454-712氨基酸区域是结合关键。体外实验显示ANLN直接结合Pol II大亚基的846-1592氨基酸和CTD结构域。邻近连接实验(PLA)进一步验证了二者在核内的相互作用。

"ANLN和Pol II形成凝聚体并共定位于基因TSS区域"的研究表明，CUT&Tag分析显示62.67%的Pol II和64.60%的ANLN信号分布在基因启动子区。超分辨成像发现Pol II-pS5形成三类簇结构，其中大尺寸的III型簇对1,6-己二醇处理敏感。有趣的是，83.33%的观察视野中ANLN簇聚集在Pol II III型簇外围。

"ANLN增强起始相关Pol II簇形成"的实验采用短期敲低策略避免有丝分裂干扰。结果显示ANLN缺失特异性减少Pol II-pS5 III型簇，而对延伸态Pol II-pS2簇影响较小。关键发现是ANLN通过其固有无序区(IDR)中46个关键氨基酸驱动相分离，该功能不依赖于其肌动蛋白结合能力。

"ANLN促进Pol II CTD体外相分离"的体外实验显示，ANLN以浓度依赖方式增加CTD液滴尺寸和凝聚比例。在近生理浓度下，ANLN分布在CTD液滴外围，符合Pickering乳液理论。值得注意的是，低浓度RNA促进而高浓度RNA抑制ANLN-CTD凝聚体形成。相分离突变体(PS mut)显著削弱了促进CTD相分离的能力。

"ANLN调控基因转录活性和Pol II染色质结合"部分发现，ANLN敲低导致1227个基因下调，其中168个基因表达量降低2倍以上。下调基因显著富集于Wnt、KRAS和Hippo等癌症通路。CUT&Tag分析揭示ANLN缺失导致H3K27ac信号减弱而Pol II染色质结合增加，类似转录暂停异常现象。

"鉴定ANLN直接靶基因"的研究整合RNA-Seq和CUT&Tag数据，鉴定出84个ANLN-Pol II轴直接调控的靶基因，包括CCND1和TXNRD1等癌基因。这些基因与氧化还原酶活性、细胞分化和Wnt信号传导相关。值得注意的是，9个靶基因在食管鳞癌中受超级增强子调控，ANLN和Pol II共同占据这些活性位点。

"THZ1抑制ANLN-Pol II簇和ESCC细胞增殖"的实验表明，0.1μM THZ1处理3小时即可溶解ANLN-Pol II III型簇。84个ANLN靶基因对THZ1处理特别敏感。MTS实验显示THZ1对7种ESCC细胞系的IC₅₀为0.009-0.167μM，且与ANLN抑制剂F806联用具有协同效应。

这项研究系统阐明了核ANLN作为转录调控因子的全新功能，突破了传统认知中ANLN仅作为有丝分裂蛋白的局限。研究发现ANLN通过相分离机制调控Pol II簇形成，建立了细胞骨架蛋白与转录调控的直接联系。特别值得注意的是，ANLN-Pol II轴靶向的超级增强子调控基因为食管鳞癌治疗提供了特异性靶点。THZ1能特异性破坏ANLN-Pol II凝聚体，与F806联用可同时靶向ANLN的核质功能，这种双靶向策略为癌症治疗提供了新思路。该研究不仅拓展了对ANLN生物学功能的认识，也为开发基于转录凝聚体调控的抗癌药物奠定了理论基础。