Neddylation 修饰 RhoA 蛋白：糖尿病肾病肾间质纤维化进程的关键推手

为探究 neddylation 在糖尿病肾病（DN）肾纤维化中的作用，研究人员利用小鼠模型及细胞实验开展研究。结果发现 neddylation 通路关键成分上调，抑制其可减轻肾纤维化。该研究为 DN 治疗提供新靶点，有重要意义。

　　在健康医学领域，糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病常见且严重的并发症，堪称慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease，CKD）的 “头号帮凶”，严重威胁着全球人们的肾脏健康。它的病理特征复杂，像肾小球基底膜增厚、系膜扩张以及肾小管间质纤维化等，其中肾小管间质纤维化在 DN 的发展进程中起着关键作用。肾小管上皮细胞（Renal Tubular Epithelial Cells，RTECs）在肾纤维化中 “身兼两职”，既是受损的受害者，又是纤维化进程的启动者。

然而，DN 的发病机制却如同迷雾，让人难以捉摸。近年来，neddylation 通路逐渐进入研究者的视野，它作为一种关键的蛋白质翻译后修饰（Post - translational Modification，PTM）过程，参与了众多细胞活动，在多种疾病中都有异常表现，如在癌症中异常激活，与患者不良预后相关。在纤维化疾病方面，虽然已有研究暗示其参与，但 neddylation 在肾纤维化中的具体作用及机制仍是未解之谜。为了拨开这层迷雾，东南大学医学院附属南京鼓楼医院等机构的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Acta Pharmacologica Sinica》上。

研究人员运用了多种关键技术方法。在动物实验中，构建了链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病小鼠模型和单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）小鼠模型；在细胞实验方面，培养了人近端肾小管上皮细胞（HK - 2）和 HEK293T 细胞。还采用了免疫沉淀 - 质谱分析（Immunoprecipitation - Mass Spectrometry，IP - MS）、RNA 测序（RNA - seq）、蛋白质免疫印迹（Western blot analysis）、实时荧光定量聚合酶链式反应（Real - time PCR）等技术，从多个层面探究 neddylation 与肾纤维化的关系。

研究结果

1. neddylation 通路在糖尿病小鼠肾脏及高糖刺激的 HK - 2 细胞中激活：通过蛋白质免疫印迹分析发现，STZ 诱导的糖尿病小鼠肾脏中，neddylation 通路的关键成分 NAE1（NEDD8 - activating enzyme E1 subunit 1）和 NEDD8 水平显著升高，同时纤维化标志物胶原蛋白 I（collagen I）和 α - 平滑肌肌动蛋白（α - Smooth Muscle Actin，α - SMA）也增多。免疫荧光染色显示，糖尿病小鼠近端肾小管中 NEDD8 表达上调，且 NEDD8 高表达区域的 collagen I 表达也增加。在高糖（High Glucose，HG）刺激的 HK - 2 细胞中，NAE1 和 NEDD8 的表达同样显著上升。对 CKD 患者肾活检组织的转录组数据分析以及对 DN 患者肾活检组织的检测，均证实了 NAE1 和 NEDD8 的高表达。
2. NAE1 和 NEDD8 在 UUO 小鼠纤维化肾脏中上调：在 UUO 小鼠模型中，术后 7 天肾脏出现明显损伤。免疫荧光分析表明，肾脏肾小管中 NEDD8 水平显著升高，且与近端肾小管标记物莲四叶凝集素（Lotus Tetragonolobus Lectin，LTL）以及纤维化标志物 collagen III 和 α - SMA 共定位。蛋白质免疫印迹定量分析进一步证实了 UUO 小鼠肾脏中 NAE1 和 NEDD8 的表达上调，这表明 neddylation 通路过度激活在肾纤维化发展中意义重大。
3. 基因敲低或药物抑制 NAE1 减轻 HK - 2 细胞纤维化表型：以 HK - 2 细胞为体外模型，使用 MLN4924（一种靶向 NAE1 的小分子抑制剂）抑制 NAE1，可有效抑制 HG 诱导的 collagen I 和 α - SMA 表达，还能降低炎症细胞因子白细胞介素 6（Interleukin - 6，IL - 6）和单核细胞趋化蛋白 1（Monocyte Chemoattractant Protein - 1，MCP - 1）的 mRNA 表达。在转化生长因子 - β1（Transforming Growth Factor - β1，TGF - β1）诱导的 HK - 2 细胞损伤模型中，MLN4924 同样能抑制 collagen I 和 α - SMA 的表达。通过小干扰 RNA（siRNA）敲低 NAE1，也能得到类似的结果，凸显了 NAE1 在介导 TGF - β1 促纤维化作用中的重要性。
4. AAV9 介导的 NAE1 沉默对糖尿病小鼠肾脏损伤和纤维化的保护作用：研究人员利用腺相关病毒 9（Adeno - Associated Virus 9，AAV9）携带 NAE1 的短发夹 RNA（shRNA），在糖尿病小鼠中沉默 NAE1 表达。结果显示，AAV9 能有效降低 RTECs 中的 NAE1 表达。虽然 AAV9 - NAE1 处理对小鼠肾脏重量与体重比（KW / BW）无影响，但显著降低了尿白蛋白水平，减轻了肾小球肥大、系膜基质扩张和肾小管间质纤维化等病理变化，同时减少了 collagen I 和 α - SMA 的蛋白水平，表明 NAE1 沉默对糖尿病肾脏具有保护作用，是 DN 潜在的治疗靶点。
5. NEDD8 与 RhoA 相互作用阻碍 RhoA 蛋白降解：通过 IP - MS 分析，发现 NEDD8 - cullins 与 RhoA 存在强相互作用。KEGG 通路分析显示，内吞作用信号通路等可能与 NEDD8 介导的效应相关。在糖尿病小鼠中，RTECs 中 NEDD8 和 RhoA 的共定位显著上调，Co - IP 实验从外源性和内源性层面证实了 NEDD8 与 RhoA 的直接相互作用，表明 RhoA 是 NEDD8 的底物。CHX（Cycloheximide）追赶实验表明，抑制 neddylation 可缩短 RhoA 的半衰期，加速其降解，且该降解过程部分依赖泛素 - 蛋白酶体途径。过表达实验进一步证实，抑制 neddylation 会减少 RhoA 的 neddylation 修饰，增加其泛素化修饰，揭示了 neddylation 通路通过抑制泛素 - 蛋白酶体介导的降解来稳定 RhoA 蛋白。
6. neddylation 触发的 RhoA 稳定性促进肾纤维化：分析 GSE66494 数据集发现，CKD 患者（包括 DN 患者）肾脏中 RhoA mRNA 水平高于健康对照，且 RhoA mRNA 表达与 NEDD8 mRNA 表达呈正相关。在 STZ 诱导的糖尿病小鼠纤维化肾脏中，RhoA 蛋白水平显著升高，体内外实验均表明，敲低 NAE1 可降低 RhoA 蛋白水平。在 HK - 2 细胞中过表达 NEDD8，RhoA 蛋白水平相应增加。使用 RhoA 激活剂 narciclasine 增强纤维化蛋白表达，抑制 NAE1 可部分抑制 TGF - β1 诱导的促纤维化表型，表明 neddylation 介导的纤维化进程依赖于 RhoA 水平。
7. neddylation 激活 RhoA 和 ERK1/2 信号通路：对 MLN4924 处理的 HK - 2 细胞进行 RNA - seq 分析，KEGG 分析显示，MAPK（Mitogen - Activated Protein Kinase）等信号通路富集。进一步研究发现，MLN4924 选择性抑制 ERK1/2 的磷酸化，对 JNK 和 p38 的激活无影响。在糖尿病小鼠肾脏中，磷酸化 ERK1/2 水平升高，敲低 NAE1 可降低该信号。RhoA 激活剂 narciclasine 可增加 ERK1/2 磷酸化，而 MLN4924 可抑制这一作用，表明 neddylation 增强 RhoA 活性，进而激活 ERK1/2 通路。
8. NAE1 抑制剂 MLN4924 在 UUO 小鼠模型中的肾保护作用：在 UUO 小鼠模型中，给予 MLN4924 治疗后，肾脏肾小管细胞中 NAE1 表达和 NEDD8 结合蛋白水平降低。组织学分析显示，MLN4924 改善了肾脏损伤，减少了肾小管损伤和炎症，降低了纤维化标志物水平。分子水平上，MLN4924 恢复了 E - cadherin 蛋白水平，减少了促纤维化标志物的表达，表明 MLN4924 通过抑制 neddylation 通路有效减轻了 UUO 小鼠的肾小管间质纤维化。

研究结论与讨论

该研究揭示了 neddylation 在纤维化肾脏中上调，在 RTECs 中尤为活跃，是 DN 进展的重要驱动因素。NAE1 基因敲低或 MLN4924 药物抑制可有效减轻肾小管损伤，展现出治疗潜力。机制上，细胞损伤激活 neddylation 通路，NEDD8 与 RhoA 直接相互作用，通过减少其泛素化介导的降解来稳定 RhoA，进而激活 ERK1/2 信号通路，促进肾间质纤维化。

研究还发现，CKD 患者肾脏中 RhoA 表达更高，且 NEDD8 与 RhoA 的 mRNA 水平呈正相关，提示靶向 RhoA 的 neddylation 通路可能是治疗肾纤维化的新策略。同时，NAE1 在调节 RhoA 稳定性和 ERK1/2 通路激活方面具有双重作用，为理解 neddylation 与促纤维化信号通路的相互作用提供了新视角。

此外，研究也存在一些局限性。例如，NAE1 敲低降低了糖尿病小鼠的空腹血糖水平，暗示其肾保护作用可能部分通过代谢调节介导，未来需要进一步研究 neddylation 对糖脂代谢的影响。并且，利用肾小管特异性敲除 NAE1 或肾小管特异性 AAV9 介导的基因沉默，将有助于更深入了解 NAE1 在肾小管上皮细胞中的精确作用。总体而言，该研究为糖尿病肾病肾间质纤维化的治疗提供了新的靶点和理论依据，具有重要的科学意义和潜在的临床应用价值。