探究 Neddylation 修饰在糖尿病肾病肾间质纤维化中的关键作用 —— 一项重要研究解读
南京鼓楼医院东南大学医学院肾脏病研究所的研究人员 Xue-qi Li 等人在《Acta Pharmacologica Sinica》期刊上发表了题为 “Neddylation of RhoA impairs its protein degradation and promotes renal interstitial fibrosis progression in diabetic nephropathy” 的论文。该研究聚焦于糖尿病肾病(DN)中肾间质纤维化的发病机制,为糖尿病肾病的治疗提供了新的潜在靶点和理论依据,对推动糖尿病肾病治疗策略的发展具有重要意义。
一、研究背景
糖尿病肾病(DN)作为糖尿病常见且严重的并发症,是导致慢性肾脏病(CKD)的主要原因之一,在全球范围内对健康构成严重威胁。其组织病理学特征包括肾小球基底膜增厚、系膜扩张和肾小管间质纤维化,其中肾小管损伤在 DN 进展中起着关键作用。
Neddylation 是一种重要的蛋白质翻译后修饰,涉及泛素样蛋白 NEDD8 与特定靶蛋白的结合,该过程由一系列酶介导。以往研究表明,neddylation 异常激活与多种人类癌症的进展相关,并且在肝纤维化等纤维化疾病中也有涉及,但它在肾纤维化中的作用尚未明确。鉴于此,本研究旨在探究 neddylation 在肾纤维化中的作用机制,为 DN 的治疗提供新的思路。
二、研究材料与方法
(一)实验动物
选用 8 - 10 周龄的雄性 C57BL/6J 小鼠,在特定病原体 - free 条件下饲养。实验动物操作遵循 NIH 实验动物护理和使用指南,并获得南京鼓楼医院动物研究委员会的批准。
(二)实验模型
- 糖尿病小鼠模型:通过连续 5 天腹腔注射链脲佐菌素(STZ,50mg/kg)诱导小鼠糖尿病,对照组注射柠檬酸盐缓冲液。2 周后,将空腹血糖水平超过 16.7mmol/L 的小鼠纳入研究。
- 单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠模型:对小鼠进行腹腔麻醉后,结扎左侧输尿管诱导 UUO,术后缝合腹部肌肉和皮肤。部分小鼠在术后 2 天开始每隔一天腹腔注射 MLN4924(60mg/kg),共注射 3 次,对照组注射溶剂。
(三)细胞实验
使用人近端肾小管上皮细胞(HK - 2)和人胚肾细胞(HEK293T)进行实验。HK - 2 细胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基培养,HEK293T 细胞用含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 / 链霉素的 DMEM 培养基培养。实验中用不同处理因素干预细胞,如使用重组人 TGF - β1(2 或 4ng/mL)诱导细胞损伤,用 MLN4924(10μmol/L)抑制 neddylation,用 MG132(2μmol/L)抑制蛋白酶体降解,用 Narciclasine(0.1μmol/L)激活 RhoA。
(四)实验技术
- 免疫荧光染色:对肾脏切片进行脱蜡、抗原修复和通透处理,用 5% BSA 封闭后,与一抗在 4°C 孵育过夜,次日加入荧光标记的二抗,并用 DAPI 复染,通过共聚焦扫描显微镜观察。
- 蛋白质印迹分析(Western blot):从肾脏组织和培养细胞中提取蛋白质进行免疫印迹,以 β - actin 或 GAPDH 作为内参,通过密度分析定量蛋白质表达水平。
- 免疫共沉淀(Co - IP):细胞裂解后,在 Co - IP 缓冲液中与特定一抗孵育,经洗涤、洗脱等步骤,分析蛋白质 - 抗体复合物。
- 质谱分析(MS):对免疫沉淀的蛋白质进行处理后,用质谱仪分析,鉴定与 NEDD8 相互作用的蛋白质。
- 实时荧光定量 PCR(Real - time PCR):提取总 RNA 并合成 cDNA,以 β - actin 为内参,对目标基因进行定量 PCR 分析。
- RNA 测序(RNA - seq):从 HK - 2 细胞中提取总 RNA 制备测序文库,进行测序和生物信息学分析,包括差异基因表达分析和 KEGG 通路富集分析。
三、研究技术路线
研究人员首先构建糖尿病小鼠模型和 UUO 小鼠模型,观察 neddylation 通路关键成分在模型中的表达情况。然后,在体外细胞实验中,利用 HK - 2 细胞和 HEK293T 细胞,通过多种实验技术探究 neddylation 与 RhoA 的相互作用及其对 RhoA 蛋白稳定性的影响。接着,通过体内实验(AAV9 介导的 NAE1 基因沉默)验证 neddylation 对糖尿病小鼠肾脏损伤和纤维化的作用。最后,利用 RNA - seq 分析等技术,揭示 neddylation 诱导纤维化的信号通路机制。
四、研究结果
(一)糖尿病小鼠肾脏肾小管及高糖刺激的 HK - 2 细胞中 neddylation 通路的激活
通过蛋白质印迹分析发现,STZ 诱导的糖尿病小鼠肾脏中 NAE1 和 NEDD8 水平显著升高,同时纤维化标记物胶原蛋白 I 和 α - SMA 水平也升高。免疫共染色显示,糖尿病小鼠近端肾小管中 NEDD8 表达明显上调,且在 NEDD8 高表达区域胶原蛋白 I 表达增加。免疫荧光染色和数据库分析表明,高糖刺激的 HK - 2 细胞以及 CKD 患者肾脏活检组织中 NAE1、UBE2M、UBE2F 和 NEDD8 基因表达均显著上调,DN 患者肾脏活检组织中 NAE1 和 NEDD8 表达水平高于正常肾脏组织。
(二)UUO 小鼠模型纤维化肾脏中 NAE1 和 NEDD8 上调
在 UUO 小鼠模型中,术后 7 天肾脏出现损伤,H&E 和 Masson 染色可观察到明显变化。免疫荧光分析显示,UUO 小鼠肾小管中 NEDD8 水平显著升高,且主要与近端肾小管标记物 LTL 以及纤维化标记物胶原蛋白 III 和 α - SMA 共定位。蛋白质印迹定量分析进一步证实了 UUO 肾脏中 NAE1 和 NEDD8 表达上调,表明 neddylation 通路在肾脏纤维化发展中起重要作用。
(三)NAE1 基因敲低或药物抑制减轻 HK - 2 细胞纤维化表型
在体外实验中,用 MLN4924 抑制 HG 刺激的 HK - 2 细胞中 NAE1 的活性,可有效抑制胶原蛋白 I 和 α - SMA 的表达,降低炎症细胞因子 IL - 6 和 MCP - 1 的 mRNA 表达。用 TGF - β1 诱导 HK - 2 细胞损伤后,MLN4924 同样能抑制胶原蛋白 I 和 α - SMA 的表达。此外,通过 siRNA 敲低 NAE1 也能得到类似结果,表明 NAE1 在介导 TGF - β1 的促纤维化作用中具有重要意义。
(四)AAV9 介导的 NAE1 沉默保护糖尿病小鼠肾脏免受损伤和肾小管间质纤维化
在糖尿病小鼠模型中,AAV9 成功递送 NAE1 敲低质粒,免疫荧光证实 RTECs 中 NAE1 表达降低。糖尿病小鼠出现体重减轻和高血糖症状,AAV9 - NAE1 治疗虽未改变肾脏重量与体重比,但显著降低了尿白蛋白水平。组织病理学分析显示,AAV9 - NAE1 治疗减轻了糖尿病小鼠肾小球肥大、系膜基质扩张和肾小管间质纤维化等病理变化,蛋白质印迹分析也证实了胶原蛋白 I 和 α - SMA 蛋白水平降低,说明 NAE1 沉默对糖尿病肾脏具有保护作用,是 DN 潜在的治疗靶点。
(五)NEDD8 与 RhoA 的相互作用阻碍 RhoA 蛋白降解
通过 Co - IP 结合 MS 分析发现,NEDD8 - cullins 与 RhoA 在 HK - 2 细胞中有强烈相互作用。KEGG 通路分析表明,内吞作用信号通路等可能与 NEDD8 相关底物蛋白有关。免疫共染色显示,糖尿病小鼠 RTECs 中 NEDD8 和 RhoA 的共定位显著上调。Co - IP 实验在 HEK293T 细胞和 HK - 2 细胞中进一步证实了 NEDD8 与 RhoA 的直接相互作用,表明 RhoA 是 NEDD8 的底物。CHX 实验表明,MLN4924 抑制 neddylation 可缩短 RhoA 的半衰期,加速其降解,且该降解作用可被蛋白酶体抑制剂 MG132 部分阻断。过表达实验证实 MLN4924 可减少 RhoA 的 neddylation,增加其泛素化,说明 neddylation 通路通过抑制 RhoA 的泛素 - 蛋白酶体介导的降解来稳定 RhoA。
(六)neddylation 触发的 RhoA 稳定性促进肾纤维化
分析 GSE66494 数据集发现,CKD 患者肾脏中 RhoA mRNA 水平高于健康对照组,且 RhoA mRNA 表达与 NEDD8 mRNA 表达呈正相关。在 STZ 诱导的糖尿病小鼠纤维化肾脏中,RhoA 蛋白水平显著增加,体内外实验中 NAE1 敲低均降低了 RhoA 蛋白水平。在 HK - 2 细胞中,转染 Flag - NEDD8 质粒后,外源性 RhoA 蛋白水平随 NEDD8 表达增加而显著升高。用 RhoA 激活剂 Narciclasine 处理细胞后,抑制 NAE1 可部分抑制 TGF - β1 诱导的促纤维化表型,表明 neddylation 介导的纤维化进展依赖于 RhoA 水平。
(七)neddylation 激活 RhoA 和 ERK1/2 信号通路
对 MLN4924 处理的 HK - 2 细胞进行 RNA - seq 分析和 KEGG 通路富集分析,发现与癌症、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)等相关通路富集。进一步分析发现,MLN4924 选择性抑制 ERK1/2 磷酸化,对 JNK 和 p38 激活无影响。糖尿病小鼠肾脏中,磷酸化 ERK1/2 水平升高,NAE1 敲低可降低该信号。RhoA 激活剂 Narciclasine 可增加 ERK1/2 磷酸化,该作用可被 MLN4924 抑制,说明 neddylation 增强 RhoA 活性,进而激活 ERK1/2 通路。
(八)NAE1 抑制剂 MLN4924 在 UUO 小鼠模型中发挥肾保护作用
在 UUO 小鼠模型中,MLN4924 处理有效降低了肾小管细胞中 NAE1 表达和 NEDD8 结合蛋白水平。组织学分析显示,MLN4924 改善了肾脏损伤,减少了肾小管损伤和炎症,纤维化标记物显著降低。分子水平上,MLN4924 恢复了 E - cadherin 蛋白水平,降低了促纤维化标记物的表达,表明 MLN4924 通过抑制 neddylation 通路有效减轻 UUO 小鼠肾小管间质纤维化。
五、研究结论与讨论
本研究表明,neddylation 在纤维化肾脏中上调,在 RTECs 中尤为活跃,促进了 DN 的进展。NAE1 基因敲低或使用 MLN4924 抑制 neddylation,均可有效减轻肾小管损伤,具有治疗潜力。机制上,细胞损伤激活 neddylation 通路底物,使 NEDD8 与 RhoA 直接相互作用,通过减少 RhoA 的泛素化降解来稳定 RhoA,进而激活 ERK1/2 信号通路,促进肾间质纤维化。
通过 AAV9 介导的 NAE1 基因沉默在糖尿病小鼠中的实验,进一步证实了 neddylation 在 DN 中的关键促纤维化作用。MLN4924 作为一种正在进行癌症治疗 I/II 期临床试验的 neddylation 抑制剂,在本研究中显示出对肾间质纤维化的改善作用,有望成为治疗肾纤维化的新型药物。
研究还发现,neddylation 是 RhoA 的一种新型翻译后修饰方式,影响其稳定性和功能。CKD 患者肾脏中 RhoA 表达升高,且 NEDD8 与 RhoA 的 mRNA 水平呈正相关,提示靶向 RhoA 的 neddylation 通路可能是治疗肾纤维化的新策略。
然而,本研究也存在一定局限性。NAE1 敲低降低了糖尿病小鼠的空腹血糖水平,表明 NAE1 可能在糖代谢中起作用,其肾保护作用可能部分通过代谢调节介导,未来需进一步研究 neddylation 对糖脂代谢的影响。此外,通过肾小管特异性敲除 NAE1 或使用肾小管特异性 AAV9 介导的基因沉默,将有助于更深入了解 NAE1 在肾小管上皮细胞中的精确作用。
总体而言,该研究揭示了 neddylation 在肾纤维化中的新作用,为糖尿病肾病的治疗提供了新的潜在靶点和理论依据,对推动糖尿病肾病治疗策略的发展具有重要意义。