高度近视性白内障研究新突破:DDR2 - Hippo 通路与铁死亡的关键作用
近日,复旦大学附属眼耳鼻喉科医院(Eye Institute and Department of Ophthalmology, Eye & ENT Hospital, Fudan University)的研究人员在《Cell Death and Disease》期刊上发表了题为 “Enhanced ferroptosis sensitivity promotes the formation of highly myopic cataract via the DDR2 - Hippo pathway” 的论文。该研究揭示了铁死亡在高度近视性白内障(HMC)发展中的关键作用及潜在机制,为 HMC 的治疗提供了新的靶点和理论依据,在眼科疾病研究领域具有重要意义。
研究背景
高度近视在全球的患病率呈上升趋势,已成为严峻的健康挑战。高度近视性白内障作为高度近视最常见的并发症,发病年龄比年龄相关性白内障更早,严重影响患者工作期间的生活质量。由于晶状体核通常较硬,HMC 的手术干预难度较大,因此深入了解其发病机制对开发潜在治疗方法至关重要。
以往研究表明,抗氧化和 α - 晶状体蛋白基因的高度甲基化表观遗传修饰促使 HMC 提前发病,但这些研究未能充分解释 HMC 严重核混浊的原因。铁死亡作为一种程序性细胞死亡方式,其特征为氧化还原活性铁水平升高和脂质过氧化增加,已被证实参与年龄相关性白内障的形成,但在 HMC 中的作用尚未明确。鉴于 HMC 晶状体与铁死亡存在诸多关联特征,如丙二醛(MDA)水平升高、氧化活性物质增多和谷胱甘肽(GSH)减少等,研究人员推测铁死亡可能是 HMC 发展的重要机制。
研究材料与方法
- 样本采集:研究纳入了高近视(眼轴长度≥26.00mm)和正视(眼轴长度 22.00 - 24.50mm)患者的晶状体囊样本。在白内障手术中获取前晶状体囊,用于细胞染色、铁死亡诱导处理、RNA 提取和蛋白质分离等实验。同时,构建了晶状体诱导的高度近视小鼠模型,获取小鼠晶状体囊进行相关检测。
- 实验技术
- 透射电子显微镜(TEM):用于观察晶状体上皮细胞线粒体形态,评估铁死亡对细胞超微结构的影响。
- RNA 测序:提取人晶状体上皮样本的总 RNA,进行文库构建和测序,分析差异表达基因,筛选与铁死亡相关的基因。
- 细胞培养与转染:培养 SRA 01/04 人晶状体上皮细胞系,构建 DDR2 过表达(DDR2 - OE)、YAP1 过表达(YAP1 - OE)和 Src 敲低的细胞系,用于研究基因功能和信号通路。
- 细胞活力检测:采用 CCK - 8 法检测细胞活力,评估铁死亡诱导剂和抑制剂对细胞生存能力的影响。同时,运用 Hoechst 33342/PI(HO/PI)染色、Annexin V/Propidium Iodide(PI)双染色和 caspase 3/7 检测等方法分析细胞死亡方式。
- 生化指标检测:通过特定的染色和检测试剂盒,测定细胞内铁离子、脂质过氧化、活性氧(ROS)、MDA 和 GSH/GSSG 等指标水平,评估铁死亡进程。
- 分子生物学技术:运用定量 PCR(qPCR)、Western blotting、免疫共沉淀(Co - IP)、双荧光素酶报告基因检测和免疫荧光等技术,研究基因表达、蛋白质相互作用和信号通路的调控机制。
- 动物模型与白内障评估:通过前房注射 RSL3 构建小鼠白内障模型,利用光学相干断层扫描(OCT)和图像分析软件评估白内障的严重程度。
研究技术路线
研究人员首先评估 HMC 晶状体上皮细胞的铁死亡敏感性,通过检测细胞内 Fe2?和脂质过氧化水平、观察线粒体形态等指标,发现 HMC 晶状体上皮细胞对铁死亡更为敏感。接着,运用 RNA 测序技术筛选出 HMC 中差异表达的基因,确定 DDR2 为关键上调基因。构建 DDR2 - OE 细胞系,深入研究 DDR2 对铁死亡敏感性的影响及作用机制。进一步探究 DDR2 通过 Hippo 通路调节铁死亡的具体机制,明确 YAP1 和 WWTR1 等关键分子的作用。最后,通过体内外实验验证抑制 DDR2 介导的铁死亡对 HMC 形成的影响。
研究结果
- 高度近视晶状体对铁死亡敏感性增加:研究人员利用 FerroOrange 和 C11/BODIPY 对人及小鼠晶状体上皮细胞进行检测,发现 HMC 患者晶状体上皮细胞内的 Fe2?和脂质过氧化水平显著高于年龄相关性白内障(ARC)患者。TEM 结果显示,经铁死亡诱导剂 RSL3 处理后,HMC 晶状体上皮细胞线粒体更为凝聚,嵴结构恶化。在小鼠实验中,高度近视晶状体上皮细胞同样表现出更高的 Fe2?和脂质过氧化水平,且在体外培养时,经 RSL3 处理后高度近视晶状体的核混浊程度比对照眼更严重。这些结果表明,高度近视晶状体对铁死亡的敏感性增强。
- DDR2 上调增强高度近视晶状体的铁死亡敏感性:对人晶状体上皮样本进行 RNA 测序,筛选出 HMC 与 ARC 相比差异表达的基因。在与铁死亡相关的基因中,DDR2 和维生素 D 受体(VDR)较为突出,但 VDR 在晶状体上皮细胞中的表达水平过低。构建 DDR2 - OE 的 SRA 01/04 细胞系后发现,该细胞系在铁死亡诱导剂处理下,细胞活力下降更明显,ROS、脂质过氧化、Fe2?和 MDA 水平升高。此外,实验证明 RSL3 诱导的细胞死亡主要是铁死亡,而非凋亡或自噬。这一系列实验表明,DDR2 过表达显著增强了高度近视晶状体的铁死亡易感性。
- DDR2 通过 Hippo 通路促进铁死亡敏感性:研究发现,DDR2 过表达可调节 Hippo 通路下游效应分子 YAP1 和 WWTR1 的核定位。DDR2 - OE 细胞中,YAP1 和 WWTR1 的核水平增加,同时 Hippo 通路靶基因 CTGF 和 CYR61 的 mRNA 水平显著升高。构建 YAP1 - OE 细胞系后发现,YAP1 过表达增强了细胞对铁死亡的敏感性,且能调节关键铁死亡相关基因的表达,如上调 ACSL4 和 TfR1,下调 GPX4。双荧光素酶报告基因检测证实 YAP1 与转录因子 TEAD4 协同作用,直接结合 ACSL4 和 TfR1 的启动子,增强其转录活性。免疫沉淀实验表明,YAP1 通过增加 GPX4 的泛素化水平,降低其蛋白水平。在原代晶状体上皮细胞中也观察到类似的基因表达变化。这些结果表明,DDR2 通过 YAP1 的核转位及随后对铁死亡相关基因的调节,增强了铁死亡敏感性。
- DDR2 通过与 Src 相互作用调节 Hippo 通路:Co - IP 实验证实 DDR2 与 Src 存在相互作用,且在 DDR2 - OE 细胞中这种相互作用增强。在 DDR2 - OE 细胞中敲低 Src 后,YAP1、CTGF 和 CYR61 的表达下降,YAP1 和 WWTR1 的核水平降低,DDR2 - OE 细胞增强的铁死亡敏感性得到挽救。这表明 DDR2 通过与 Src 相互作用调节 Hippo 通路。
- 抑制 DDR2 介导的铁死亡减轻高度近视小鼠白内障形成:实验表明,DDR2 抑制剂 Dasatinib、YAP1 抑制剂 Verteporfin、Src 抑制剂 Saracatinib 和铁死亡抑制剂 Ferrostatin - 1 均能不同程度地挽救 DDR2 - OE 细胞因 RSL3 诱导的死亡。在小鼠晶状体体外培养实验中,Ferrostatin - 1 和 Dasatinib 可减轻高度近视晶状体因 RSL3 处理导致的混浊。体内实验中,向高度近视小鼠前房注射 RSL3 可诱导核白内障形成,而使用 Ferrostatin - 1 和 Dasatinib 能缓解晶状体混浊。这些结果表明,抑制 DDR2 活性和铁死亡能够减轻与铁死亡相关的 HMC 形成。
研究结论与讨论
该研究表明,高度近视眼睛的晶状体上皮细胞对铁死亡更为敏感,这是导致 HMC 严重核混浊的关键因素。DDR2 的过表达通过 Src - Hippo 信号通路增强了铁死亡敏感性。体内前房注射 RSL3 可在高度近视小鼠模型中诱导更严重的晶状体核混浊,而铁死亡和 DDR2 抑制剂能够部分改善这种情况。这些发现揭示了铁死亡在 HMC 发病机制中的功能和机制,确定 DDR2 介导的铁死亡为 HMC 干预的潜在治疗靶点。
以往研究已发现高度近视眼睛存在更多与铁死亡相关的特征,本研究进一步证实了 HMC 晶状体上皮细胞对铁死亡的高敏感性。YAP1/WWTR1 在调节铁死亡中具有重要作用,不同研究虽发现其下游靶点存在差异,但在本研究中,YAP1 的核转位通过调节 ACSL4、TfR1 和 GPX4 等关键铁死亡调节基因,增强了晶状体对铁死亡的敏感性。此外,研究推测高度近视眼中房水中较高水平的 TGF - β1 可能是晶状体上皮细胞中 DDR2 表达增加的潜在原因之一。
综上所述,该研究为深入理解 HMC 的发病机制提供了新视角,为开发针对 HMC 的有效治疗策略奠定了理论基础,有望推动眼科领域在 HMC 治疗方面取得新的突破。